aacagattttgtt，其中引物对 Golden-Vpg 用于 Golden Gate 克隆，引物对 Gibson-Vpg用于闭环Gibson拼接克隆。
[0068] 提取感染有PRSV的番木瓜叶片的RNA，反转录成cDNA，以此为模板，使用上述引物 对分别进行PCR扩增，再经电泳后回收目标条带。
[0069] 2.番木瓜 eIF4E 与 PRSV-Vpg 基因克隆到 pBiFC-GG-Nl
[0070] 取经Golden-4E引物对扩增的PCR产物I. 5ul，经Golden-Vpg引物对扩增的PCR 产物 1.5ul，质粒pBiFC-GG-Nl 2ul，BsaI 酶（NEB)0.5ul，T4 DNA ligase(Promega，HC，20u/ μ 1)0. 5ul, IOx ligase buffer (Promega) lul，灭菌水 3ul，混合后 37 °C 反应 2h，再 80°C 5min，即可用于转化。将5ul反应液与TOPlO感受态混合，转化后经含卡那霉素和氯霉 素的平板筛选，获得重组子pBiFC-GG-Nl-Golden。此克隆方法为Golden Gate克隆，其示意 图见图4。
[0071] 取经Gibson-4E引物对扩增的PCR产物3ul，经Gibson-Vpg引物对扩增的PCR产 物 3ul，质粒 pBiFC-GG-Nl 3. 6ul，SfiI 酶（NEB)O. 4ul，Gibson 反应液（NEB) IOul，混合后 50°C反应lh，即可用于转化。将5ul反应液与T0P10感受态混合，转化后经含卡那霉素和氯 霉素的平板筛选，获得重组子pBiFC-GG-Nl-Gibson。此克隆方法为闭环Gibson克隆，其示 意图见图4。
[0072] 由图4可知，2个目标基因可通过Golden Gate克隆或闭环Gibson拼接克隆法同 步克隆到pBiFC-GG。左边基因1和2的序列两端的深颜色序列表示Golden Gate克隆接头 序列，右边基因1和2的序列两端的深颜色序列表示闭环Gibson拼接克隆法的接头序列。
[0073] 3.番木瓜eIF4E与PRSV-Vpg的互作研究
[0074] 1)利用质粒转化原生质体
[0075] 分别提取质粒 pBiFC-GG-Nl-Golden 和 pBiFC-GG-Nl-Gibson，由于 pBiFC-GG 以 pGreen为框架（pGreen为高拷贝的含T-DNA序列的植物表达载体，可同时用于植物的瞬 时和稳定表达），在大肠杆菌中拷贝高，因此能方便的获得较高浓度的质粒用于原生质体转 化。将烟草叶片用切片刀切成Imm条型，置于酶解液（1ml 15%cellulase RIO+lml 0. 3% macerozyme R10+1.09g 甘露醇+Iml 0.3M KCl+lml 0.3M MES，pH 5.7)中真空渗透 30min， 然后黑暗，23°C酶解3h。酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物60g离心 5min。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗，1，OOOg离心lmin，重复上述步骤，沉淀用适量 W5悬浮获得原生质体。利用PEG法将质粒pBiFC-GG-Nl-Golden和pBiFC-GG-Nl-Gibson分 别转化到原生质体，23°C暗培养24h后使用激光共聚焦显微镜观察GFP发光情况，以分析番 木瓜eIF4E与PRSV-Vpg的互作。观测结果见图5,与空载体pBiFC-GG-Nl的阴性对照相比， 结果显示，转化pBiFC-GG-Nl-Golden和pBiFC-GG-Nl-Gibson的原生质体都能观测到发光 的细胞，这表明本发明中的pBiFC-GG载体经Golden Gate克隆合闭环Gibson拼接克隆获 得的目标载体都能适用于经原生质体转化的蛋白互作研究。
[0076] 2)利用农杆菌介导的转化
[0077] 将质粒 pBiFC-GG-Nl-Golden 和 pBiFC-GG-Nl-Gibson 分别转化到含 pSoup 质粒的 农杆菌菌株GV3101中，挑取农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基中，200rpm 28°C振荡 培养至0D600为1. 0-1. 5。5000转离心5分钟，去上清液。加入5ml注射缓冲液（50mM MES pH 5. 6, IOmM MgC12, 100 μΜ acetosyringone)，轻轻悬浮。5000 转离心 5 分钟，去上清液。 重新加入注射缓冲液至0D600为0. 1-0. 3,室温黑暗培养1 一 2小时后用于注射本生烟草 (Nicotiana benthamiana)叶片。农杆菌注射使用去针头的Iml注射器，在烟草叶片下表 皮进行注射。农杆菌注射3天后的烟草叶片，在激光共聚焦显微镜下观察荧光蛋白的表达。 观测结果见图6,与携带空载体pBiFC-GG-Nl的农杆菌的阴性对照相比，结果显示，注射含 pBiFC-GG-Nl-Golden和pBiFC-GG-Nl-Gibson农杆菌的烟草叶片都能观测到发光的细胞， 这表明本发明中的pBiFC-GG载体经Golden Gate克隆合闭环Gibson拼接克隆获得的目标 载体都能适用于经农杆菌转化的蛋白互作研究。
[0078] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，包括第一目的基因表达框 和第二目的基因表达框，所述第一目的基因表达框包括第一启动子、荧光蛋白N端基因编 码序列、与荧光蛋白N端基因编码序列相连的GG克隆框、第一终止子，所述荧光蛋白N端基 因编码序列及与荧光蛋白N端基因编码序列相连的GG克隆框插入第一启动子和第一终止 子之间； 所述第二目的基因表达框包括第二启动子、荧光蛋白C端基因编码序列、与荧光蛋白C端基因编码序列相连的GG克隆框、第二终止子，所述荧光蛋白C端基因编码序列及与荧光 蛋白C端基因编码序列相连的GG克隆框插入第二启动子和第二终止子之间； 其中，所述的GG克隆框包括顺次连接的BsaI酶切位点、SfiI酶切位点、ccdB基因、SfiI酶切位点、BsaI酶切位点。2. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述第一 目的基因表达框中，GG克隆框连接在荧光蛋白N端基因编码序列的上游或下游。3. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述第二 目的基因表达框中，GG克隆框连接在荧光蛋白C端基因编码序列的上游或下游。4. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述第一 或第二目的基因表达框中，第一或第二目的基因通过GoldenGate克隆插入到GG克隆框的 BsaI酶切位点之间。5. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述第一 或第二目的基因表达框中，第一或第二目的基因通过闭环Gibson拼接插入到GG克隆框的 SfiI酶切位点之间。6. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述GG克 隆框进一步优选为SEQUENCENO. 1所示核苷酸序列。7. 如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，其特征在于，所述用 于双分子荧光互补研究的表达载体为第一目的基因表达框和第二目的基因表达框插入 pGreen载体的多克隆位点所得的重组载体。8. -种基于双分子荧光互补的蛋白相互作用检测载体的构建方法，其特征在于，包括 如下步骤： 1) 在第一、第二目的基因的5'端及3'端分别加接头序列，分别获得含有接头序列的第 一目的基因和第二目的基因，其中，所述接头序列为用于GoldenGate克隆的接头序列或用 于Gibson拼接的接头序列； 2) 取如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，将步骤（1)所得的含 有GoldenGate克隆接头序列的第一目的基因和第二目的基因通过GoldenGate克隆插入 到GG克隆框的BsaI酶切位点之间，获得所述检测载体；或 3) 取如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的表达载体，将步骤（1)所得的含 有Gibson拼接的接头序列的第一目的基因和第二目的基因通过Gibson拼接插入到GG克 隆框的SfiI酶切位点之间，获得所述检测载体。9. 一种试剂盒，其特征在于，包括了如权利要求1所述的用于双分子荧光互补研究的 表达载体，还包括用于GoldenGate克隆或Gibson拼接的接头序列，及用于GoldenGate 克隆或Gibson拼接的酶、试剂。
【专利摘要】本发明构建了一套新的用于双分子荧光互补(BiFC)研究的表达载体，载体上整合有荧光蛋白2个片段的表达框架，2个目标蛋白的基因序列能通过一步反应(Golden？Gate克隆或闭环Gibson拼接法)同时克隆到载体，分别与荧光蛋白的2个片段融合表达。因此，利用此载体进行BiFC研究时只需构建和向细胞内导入一个载体，极大地方便了植物双分子荧光互补实验的操作。该载体能兼容Golden？Gate克隆和闭环Gibson拼接法两种高效的新克隆方法，并且该载体为高拷贝的含T-DNA序列的植物表达载体，可同时用于植物的瞬时和稳定表达。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/82, G01N33/68
【公开号】CN105177041
【申请号】
【发明人】言普, 周鹏, 沈文涛, 庹德财, 黎小瑛
【申请人】中国热带农业科学院热带生物技术研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月4日