一种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法。
【背景技术】
[0002]百合是百合科百合属的多年生草本球根植物，原产于中国，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，全球已发现有至少120个品种，其中55种产于中国。近年更有不少经过人工杂交而产生的新品种，如亚洲百合、香水百合、火百合等。鳞茎含丰富淀粉，可食，亦作药用。百合鲜食干用均可。百合是中国传统出口特产。
[0003]百合从古至今都是受人们喜爱的世界名花，百合花姿雅致，叶片青翠娟秀，茎干亭亭玉立，是名贵的切花新秀，在中国百合具有百年好合美好家庭、伟大的爱之含意，有深深祝福的意义。
[0004]百合现有的繁殖方法在生产上主要有鳞片繁殖、籽球繁殖和珠芽繁殖3种，具有繁殖效率慢，成球率较低或小鳞茎生根数量较少，繁殖系数低，且易受自然条件限制的缺点，随着生物技术的发展，组织培养技术在一定程度上提高了繁殖效率，但仍具有操作复杂、成本投入大、污染率等缺点。不能满足遗传转化过程中的大批量需求。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种转化周期短、污染率低、成本低、操作简便的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法。
[0006]—种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，包括如下步骤:
[0007](A)在第一液体培养基中进行农杆菌培养；
[0008](B)进行菌液的离心，收集菌体，采用第二液体培养基重新悬浮菌体；
[0009](C)取洗净的百合鳞片浸没于重悬后的菌体中，取出百合鳞片，将其基部浸入所述第二液体培养基中，进行黑暗培养，即共培养；
[0010](D)取出共培养后的百合鳞片，置于喷雾式植物反应器中，进行百合鳞茎芽诱导，采用喷淋溶液对百合鳞茎进行喷淋处理，获得诱导的小鳞茎；
[0011](E)将诱导的小鳞茎进行移栽，进行转基因植株的筛选。
[0012]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(A)中所述第一液体培养基为LB+Rifamycin 50mg/L+Km 50mg/L，体积为250mL，培养条件为:28°C,200rpm, 0D600 = 0.6-1.0 之间。
[0013]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(B)中所述菌液在6000rpm条件下进行离心，收集菌体，用1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L重新悬浮菌体，至0D600 = 0.6-1.0之间。
[0014]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(C)为共培养过程，具体包括如下步骤:
[0015]取洗净的百合鳞片浸没于重悬后的菌体中15分钟，取出百合鳞片后将其置于培养容器中，所述培养容器包括培养盘和与其匹配的盘盖，所述培养盘由深色塑料制成，包括盘底和4个培养盘侧壁，均为长方形，所述盘盖由透明塑料制成，包括顶板和4个顶板侧壁，均为长方形，所述培养盘和盘盖的规格均为长18.5cm，宽14.5cm，高4.5cm ;4个所述培养盘侧壁和4个所述顶板侧壁均压制成瓦楞型以增加强度；
[0016]在所述培养盘内的底部铺设有培养基质，所述培养基质的铺设高度为1.5cm，所述培养基质为陶粒或珍珠岩；在所述培养盘内底部还包括Icm高度的第二液体培养基，所述第二培养基为去除糖和铵盐的1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L的溶液；
[0017]将所述百合鳞茎的基部向下插入固定在所述培养基质中，并使其基部浸没在所述第二培养基内，盖上所述盘盖，于28 °C黑暗培养3-5天。
[0018]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(D)具体包括如下步骤:
[0019]取出共培养后的百合鳞片，置于喷雾式植物反应器中，采用喷淋溶液喷淋处理，进行百合鳞茎芽诱导；
[0020]所述喷淋溶液为含有6-BA 5.0和NAA 1.0的溶液，设置喷雾控制系统，前15天每天喷雾6次，15天之后每天喷雾4次，每次2min，在每次喷淋结束后等待lmin，对喷雾式植物反应器底部的残液进行过滤处理后回收，回收时间2min ;13-15天鳞片基部会萌发出不定芽，40-50天即可获得诱导的小鳞茎。
[0021]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，所述喷雾式植物反应器包括第一雾培箱、第二雾培箱、水箱、回收水箱和控制系统:
[0022]所述第一雾培箱包括长方形的第一底板和顶部水平支架，所述顶部水平支架的左端通过两个第一侧支架分别与所述第一底板的左侧两端相连，所述顶部水平支架的右端通过两个第一侧支架分别与所述第一底板的右侧两端相连；所述第一雾培箱的内部包括第一培养架；所述第一底板为倾斜设置，与水平面的夹角为10?15°，在所述第一底板的较低一侧设置有第一集水槽；在所述第一培养架的上部水平设置有第一导水管，在所述第一导水管的上部从左至右依次等距设置有6个第一雾化喷头，在所述第一导水管的下部从左至右依次等距设置有7个第二雾化喷头，6个所述第一雾化喷头和7个所述第二雾化喷头均与所述第一导水管相连通；
[0023]所述第二雾培箱包括均为长方形的第二底板和顶板，所述顶板的长与所述第二底板的长一致，宽小于所述第二底板的宽，所述顶板的4个端点分别通过第二侧支架与所述第二底板的4个端点相连，所述第二雾培箱的内部包括第二培养架；所述第二底板为倾斜设置，与水平面的夹角为10?15°，在所述第二底板的较低一侧设置有第二集水槽；在所述顶板下部前后水平设置有第二导水管和第三导水管；
[0024]所述第一培养架和所述第二培养架均由上下平行设置的多个置物网构成，所述多个置物网之间为可拆卸地连接，在每个所述置物网上间隔设置有多个置物海绵；
[0025]在所述第二培养架中，在最顶端的所述置物网的下部前后水平设置有第四导水管和第五导水管，在所述第二导水管、所述第三导水管、所述第四导水管、所述第五导水管上从左至右依次等距设置有7个第三雾化喷头；
[0026]所述水箱通过第一管路与所述第一导水管相连，通过第二管路分别与所述第二导水管、所述第三导水管、所述第四导水管和所述第五导水管相连；
[0027]所述回收水箱的入口通过第三管路与所述第一集水槽的底部相连，通过第四管路与所述第二集水槽的底部相连，所述回收水箱的出口通过第五管路与所述水箱相连；
[0028]控制系统，在所述第一管路、所述第二管路、所述第三管路、所述第四管路、所述第五管路上均设置有阀门，在所述回收水箱的入口处、出口处以及所述水箱的出口处均设置有水栗和驱动装置，所述控制系统与所述驱动装置相连。
[0029]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，6个所述第一雾化喷头和7个所述第二雾化喷头为从左至右交错设置；在所述第一培养架和所述第二培养架中，相邻的上下两个所述置物网上的置物海绵为交错设置；
[0030]在所述第一雾培箱和所述第二雾培箱的底部设置有多个支撑脚，在所述支撑脚的底部固定有万向轮。
[0031]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，所述第一雾培箱和所述第二雾培箱的四周均设置有透明塑料制成的板材，其中，前部的所述板材与所述第一雾培箱或第二雾培箱之间为活动连接；所述第二雾培箱的顶板为透明塑料制成的板材；
[0032]在所述第一雾培箱和所述第二雾培箱后侧的板材外侧固定有蓝紫色光源，所述蓝紫色光源为发出蓝色光的LED灯带，呈网状布置。
[0033]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中在所述第三管路和所述第四管路上还设置有过滤装置。
[0034]本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，所述第一培养架包括3个所述置物网，所述第二培养架包括4个所述置物网。
[0035]本发明基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法相比传统方法具有如下优点:
[0036]I)农杆菌侵染、共培养都是在开放式环境下操作，不受环境条件限制，操作简便；
[0037]2)无菌侵染工作量大，而且污染率高，侵染数量有限，而基于喷雾式植物反应器的百合遗传转化可实现大批量遗传转化，开放式培养不存在污染问题；
[0038]3)本发明所述基于喷雾式植物反应器遗传转化方法使营养液的养分得到高效利用，开放式培养，更好的促进幼苗