龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法及用图

文档序号:8959515阅读:274来源:国知局
龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及工程菌株构建技术领域,特别涉及一种龙葵金属硫蛋白表面展示工程 菌的构建方法,还涉及龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的用途。
【背景技术】
[0002] 随着工业的飞速发展,各种重金属离子通过各种工业途径释放到环境中。由于重 金属具有强毒性,不可降解性和食物链富集性,因此重金属的环境污染问题得到越来越多 的重视(Nriagu and Pacyna 1988 ;Dhankhar and Hooda 2011)。而且,摄入过量的重金属 会对人的健康造成各种各样的危害(Wu et al. 2004 !Batayneh 2012)。许多处理重金属 的方法,例如离子转换,物理渗透,化学沉淀,活性炭吸附,电凝固,电渗析,超过率和溶剂萃 取等多种方法被很多的人研究(Holan et al. 1993;Arief et al.2008)。但是,通常的物 理和化学方法有成本高,去除不彻底,二次污染和专一性不强等缺点(Davis et al. 2003; Dabrowski et al. 2004 ;Akbal and Camci 2012)。更多的科学家转向生物吸附剂的研究。 (Hammaini et al. 2002 ;Kuroda and Ueda 2003, 2006 ;Arief et al. 2008 ;Kotrba and Ruml 2010 ;Kuroda et al. 2012 ;Parisutham et al. 2014 ;Tanaka and Kondo 2015)〇
[0003] 锦是一种被工业广泛应用,但对人健康又有危害的一种重金属(Pirzadeh, et al. 2012)。由于它有通过生物链富集的特性,因此,人们经常通过食物间接的摄入过量的镉 而造成对身体健康的危害(Alexander et al. 2009)。为了去除环境中的镉污染,科学家做 了很多的研究。(Gadd and White 1993 Janaka and Kondo 2015)。利用微生物,特别是表 面展示工程菌作为吸附剂,来去除镉污染,也许会成为一种有效可行的方法。

【发明内容】

[0004] 为了解决以上现有技术中去除环境中重金属常用的物理和化学方法成本高、去除 不彻底、二次污染和专一性不强等缺点,本发明提供了一种利用微生物,可以吸附镉的龙葵 金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法。
[0005] 本发明还提供了龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的用途。
[0006] 龙葵是一种镉超富集植物,这一特征与它的金属硫蛋白有着密切的关系(Ferraz et al. 2012)。但是,至今还没有人将龙葵的金属硫蛋白展示在酿酒酵母表面,来构建镉吸 附工程菌。为了提高酿酒酵母对镉的吸附能力和耐受能力,我们首次将龙葵的一种金属硫 蛋白,通过表面展示技术成功的展示在了酿酒酵母的表面。成功的构建出了一种高效吸附 重金属镉的工程菌,对其吸附性能研究表明,在镉污染处理领域有广阔的应用前景。
[0007] 本发明是通过以下步骤得到的:
[0008] -种龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌(以下简称表面展示菌株)的构建方法,其 特征在于提取龙葵金属硫蛋白基因,以PYES2为出发载体,将载体上的诱导型启动子替换 为组成型表达启动子,将酿酒酵母的分泌信号肽基因连在组成型启动子之后,将酿酒酵母 锚定蛋白凝集素基因的3'端序列连在启动子之后,将获得的龙葵金属硫蛋白基因连在分泌 信号肽基因和凝集素基因之间,将构建好的表达载体转入大肠杆菌扩增得组成型表达表面 展示载体,提取载体质粒,转入酿酒酵母。
[0009] 所述的构建方法,优选提取龙葵金属硫蛋白基因包括以下步骤:
[0010] ⑴提取龙葵的RNA,
[0011] (2)通过反转录得到龙葵的cDNA,
[0012] (3)以cDNA为模板,通过PCR的方法扩增出龙葵的金属硫蛋白基因,
[0013] (4)琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,连接T载体,转化大肠杆菌,
[0014] (5)挑选阳性克隆,培养,菌液PCR,测序确定,
[0015] (6)质粒提取,
[0016] (7)酶切获得带酶切位点的龙葵金属硫蛋白基因片段。
[0017] 所述的构建方法,优选构建表达载体操作如下:
[0018] (1)以酿酒酵母穿梭表达载体PYES2为出发载体,将pYES2上的诱导型启动子 GALl替换为酿酒酵母组成型强启动子,丙糖磷酸异构酶启动子TPI,得到组成型表达载体 pYES2-Tpi ;
[0019] (2)以质粒pPIC9K为模板,以带有Mfe I和Spe I酶切位点的酵母分泌信号肽基 因 alpha factor 扩增引物 Alpha factor-Forward 和 Alpha factor-Reverse,PCR 扩增出 酵母分泌信号肽基因 alpha factor,用Mfe I和Spe I酶切消化获取的分泌信号肽段alpha factor,连接到经过EcoR I和Xba I酶切消化的酿酒酵母组成型表达载体pYES2-Tpi上, 得到重组质粒pYES2_Tpi_alpha ;
[0020] (3)以酿酒酵母基因组DNA为模板,以带有EcoR I和Not I酶切位点的酿酒酵 母锚定序列凝集素3'端序列AG扩增引物AG a I-Forward和AG α Ι-Reverse,进行PCR扩 增,用EcoR I和Not I酶切消化获取的锚定序列凝集素3'端序列AG,连接到同样经过 EcoR I和Not I酶切消化的pYES2-TPI-alpha上,经菌落PCR筛选和测序分析得重组质粒 pYES2-Tpi-alpha-AG。
[0021] (4)将龙葵金属硫蛋白基因,连接到经EcoR I和Mlu I消化的重组质粒 pYES2-Tpi-alpha-AG 上;
[0022] 上述操作中用到的引物序列如下:
[0024] 所述的构建方法,优选步骤(1)中是以酿酒酵母DNA为模板,以带有Spe I和Eco R I的引物TPI-Forward和TPI-Reverse PCR扩增出丙糖磷酸异构酶启动子基因,然后用 Spe I和Eco R I酶切消化基因片段,连接到经过Spe I和Eco R I消化的pYES2上。
[0025] 所述的构建方法,优选提取表达载体,转入酿酒酵母的操作包括:
[0026] (1)制备酿酒酵母感受态细胞;
[0027] (2)载体质粒电击转化入酿酒酵母感受态细胞;
[0028] (3)对步骤⑵得到的细胞进行培养。
[0029] 所述的构建方法所得到的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌在吸附重金属镉中的 用途。
[0030] 将龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌接种到含有Cd2+的环境中,对Cd2+进行吸附。
[0031] 龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌在Cd2+浓度小于等于0. 5mM的环境中接种。
[0032] 首次通过a凝集素表面展示系统将龙葵(Solanum nigrum)金属硫蛋白 (metallothionein)展不在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞表面。通过 RT-PCR的方法获得镉超富集植物龙葵的一种金属硫蛋白基因,命名为SMT 2a gene,用 PYES2作为构建表面展示的载体。通过电转化的方法将表达载体转入酿酒酵母,实现了龙葵 金属硫蛋白在酿酒酵母中的组成型表达,并将其成功的展示在了酿酒酵母的表面。获得了 一种高效吸附重金属镉的工程酵母菌。
[0033] 本发明的有益效果:
[0034] 1、本发明构建的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌,镉吸附能力显著高于野生型酵 母株和对照菌株,对Cd2+具有更强的吸附能力;
[0035] 2、本发明构建的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌,对镉耐受能力也得到了显著的 提升;
[0036] 3、本发明构建的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌,吸附超痕量重金属的能力显著 高于野生型酵母株和对照菌株;
[0037] 4、本发明构建的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌能在较大的pH范围内有效吸附 重金属镉;
[0038] 5、本发明构建的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌能在Cd2+和Cu2+或Cd2+者Hg 2+共 存的情况下吸附重金属镉。
【附图说明】
[0039] 图1为表面展示载体的结构;
[0040] 图2为酵母菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图;
[0041] 图3为不同酵母菌在含有0. 5mM CdSOd^培养基中的生长情况,▲本发明获得的 表面展示酵母菌;·对照酵母菌;?野生型出发菌株;
[0042] 图4 pH对Cd2+吸附性能的影响,柱状图中3个柱自左至右依次为出发菌株、对照 菌株和表面展示菌株;
[0043] 图5.共存Cu2+离子对Cd2+吸附性能的影响,柱状图中3个柱自左至右依次为出发 菌株、对照菌株和表面展示菌株;
[0044] 图6.共存Hg2+离子对Cd2+吸附性能的影响,柱状图中3个柱自左至右依次为出发 菌株、对照菌株和表面展示菌株。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
[0046] 实施例1
[0047] -、龙癸金属硫蛋白基因的获得
[0048] 1、龙葵RNA的提取
[0049] 取50-100mg植物组织,在液氮中磨成粉末后,按照购自Takara的RNA提取试剂盒 RNAiso Plus操作说明提取龙葵的总RNA。
[0050] 2、cDNA 的合成
[0051] 以龙葵的总RNA为模板,按照下述反应体系合成cDNA
[0052] 5X Reverse Transcriptase Buffer : 4 μ L
[0053] dNTP mix (IOmM) : 2 μ L
[0054] RNase inhibitor (40U/ μ L) : 0. 5 μ L
[0055] Oligo (dT)primer: 0. 5 μ L
[0056] AMV Reverse Transcriptase: 2 μ L
[0057] RNA templet: 2 μ L
[0058] RNase-free ddH20: 定容至 20 μ L
[0059] 反应混合物37°C水浴60min,在70°C加热IOmin结束反应,置冰上进行后续实验或 冷冻保存。
[0060] 3、金属硫蛋白基因的获取
[0061] 以cDNA为模板,通过PCR的方法扩增出龙葵的金属硫蛋白基因,所用到的引物为 (带有Eco R I和Mlu I两个酶切位点):
[0062] 5' -GAATTCATGTCTTGCTGTGGAGGA-3 ' (Eco R I GAATTC)
[0063] 5' -ACGCGTTTAGAGCAAGTGCAAGGG-3' (Mlu I ACGCGT)。
[0064] 4、带有粘性末端基因的获取
[0065] (1)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收片段,然后将回收片段按照试剂盒 方法连接T载体,热击转化大肠杆菌,
[0066] (2)将转化菌液涂LB平板,37°C恒温培养至克隆产生,
[0067] (3)根据蓝白斑,挑选阳性克隆,LB培养过夜,
[0068] (4)菌液PCR,对阳性克隆测序确定是金属硫蛋白基因,
[0069] (5)按照购自Takara的质粒提取试剂盒,提取质粒,
[0070] (6)用Eco R I和Mlu I对提取的质粒进行酶切,获得带酶切位点的目的基因片 段,命名为SMT2a。
[0071] 二、组成型表达表面展示载体的构建
[0072] 1、以酿酒酵母穿梭表达载体pYES2为出发载体,将pYES2上的诱导型启动子GALl 替换为酿酒酵母组成型强启动子,丙糖磷酸异构酶启动子TPI。该段基因是以酿酒酵母DNA 为模板,以带有Spe I和Eco R I的引物(ΤΡΙ-Forward和TPI-Reverse)PCR扩增出丙
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