绒毛白蜡耐盐的FvSnRK2.1基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及绒毛白蜡耐盐的FvSnRK2. 1基因及其应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 高盐胁迫是限制植物和农作物地域分布的主要环境因素，也是影响农作物产量的 最主要的非生物胁迫之一。高盐胁迫可以影响植物的生长发育，此外，还会促进植物体内生 成过多的ROS和次生代谢产物，对植物细胞形成氧化胁迫等毒害。植物在长期进化过程中 逐步形成了一系列响应逆境的生物机制，其中植物激素脱落酸（abscisic acid，ΑΒΑ)起了 很重要的作用。近年来，有关ABA信号转导分子机制的研究越来越多，其中最为突出的进 展则是ABA受体PYR/PYL/RCAR蛋白和其下游蛋白质磷酸化系统的发现。随后提出了 ABA 信号转导的双重负调控系统（PYR/PYL/RCAR - IPP2C - I SnRK2)，将PYR/PYL/RCAR蛋白与 调节因子如PP2C、SnRK2(sucrose non-fermenting 1-related proteinkinases 2)及其下 游元件相互联系起来，形成了一条完整的ABA信号通路，极大地加深了人们对ABA信号通路 的理解。PYR/PYL/RCARs作为ABA受体，PP2Cs作为通路的负调控者，SnRK2s作为下游信号 的正调控者（Phang et al.，2008 !Katharine et al.，2010)。越来越多的报道表明 SnRK2s 参与干旱、高盐、ABA和高渗等非生物胁迫信号途径并提高植物应对复杂环境的耐受能力， 尤其是在ABA依赖的信号途径所发挥着重要的作用，这表明SnRK2s蛋白激酶是胁迫应答中 的关键调节子。
[0003] SnRK2是一个相对较小的植物专一性蛋白激酶家族，属Ser/Thr类蛋白激酶，参与 植物体内多种信号途的转导，对植物的抗逆境生理起到非常重要的作用。从整个基因家族 的分析中发现，SnRK2蛋白激酶家族的功能同样存在多样性，在拟南芥SnRK2家族的10个 成员当中，9个能够被高渗胁迫所激活，其中只有5个能够被ABA所诱导，而都不受寒冷诱导 (Boudsocq et al.，2004)。水稻中共有10个SnRK2成员，所有的家族成员都受高渗胁迫的 诱导，其中有3个成员受ABA的诱导（Kobayashi et al.，2004)。从系谱发生分析，SnRK2 基因家族被分为3个亚家族，分别为Group I、Group II和Group III，研究表明，Group I不 受ABA的激活，Group II对ABA具有微弱的响应或不响应，而Group III受ABA的强烈激活， Group I、Group II 都能被渗透胁迫诱导（Huai et al·，2008 ;Kobayashi et al·，2004) 〇 从功能结构域研究发现，拟南芥、水稻和玉米等植物的SnRK2具有典型的N-端和C-端功 能结构域，N端催化域高度保守，C端为调控区（Kobayashi et al·，2004 ;Kobayashi et al.，2005 ;Huai et al.，2008)该C端的显著特征是具有一个富含谷氨酸或天冬氨酸（D/ E)的酸性补丁结构，根据这一特点将SnRK2分为SnRK2a亚族和SnRK2b亚族（Halford and Hardie，1998)，其中SnRK2a的C端富含天冬氨酸Asp，而SnRK2b中富含谷氨酸Glu。
[0004] 近来研究表明SnRK2家族成员在植物抗逆生理中发挥重要的作用。Fujii等 (2007)分离得到snrk2. 2、snrk2. 3单突变体和snrk2. 2/2. 3双突变的拟南芥，研究表明 只有双突变体植株表现出对ABA不敏感的特性，种子的萌发及幼苗根的生长都不受抑制 (Fujii et al.，2007)。拟南芥snrk2. 2/3/6三突变体对ABA极度不敏感，其耐旱性明显下 降（Fujii and Zhu, 2009)。拟南芥srk2c/snrk2. 8突变体对干旱敏感，而过量表AtSnRK2. 8 能够明显提高植物的耐旱性（Umezawa et al.，2004)。过量表达小麦SnRK2基因 TaSnRK2. 4 或者TaSnRK2. 8的拟南芥，耐盐、抗旱及耐低温的能力都有显著的提高（Mao et al.，2010 ; Zhang et al.，2010)。DiW dhiou (2008)将水稻SAPK4基因转入盐敏感型水稻品系IR29 中，150mmol/LNaCl溶液处理8d后，野生型株系叶片发黄萎蔫，而转基因植株叶片无明显改 变。
[0005] 已有的实验结果证实，SnRK2家族成员可以明显提高植物对干旱和盐胁迫等逆境 的抗性。虽然目前对该激酶信号途径系统中的下游组成并不十分明确，但在拟南芥和水稻 中的研究表明一些含有ABREs (ABA response elements)的转录因子可以被其磷酸化。转 录因子的活化可以启动其下游众多基因的表达，以抵御环境逆境对植物的伤害。对SnRK2 成员在逆境信号系统中的作用的研究，将对植物抗逆分子机理进行更深入的探索。随着生 物技术的发展，利用生物措施对SnRK2的进一步研究，在盐渍化问题上进行分子育种，将为 提高植物的耐盐能力起到重要的作用，也为分子育种开辟了广阔的前景。
[0006] 但目前没有关于绒毛白蜡FvSnRK2. 1基因的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种绒毛白蜡耐盐的FvSnRK2. 1基因及其应 用。
[0008] -种绒毛白蜡耐盐的FvSnRK2. 1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 一种由上述FvSnRK2. 1基因编码的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0010] -种插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。
[0011] -种重组细胞，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序 列的载体。
[0012] 上述FvSnRK2. 1基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明从域毛白錯中克隆了调控域毛白錯耐盐性的FvSnRK2. 1基因，该基因的表 达受盐胁迫的影响；本发明所述的FvSnRK2. 1基因对从整体上增强植物的耐盐性，提高其 稳定性，将有巨大的应用前景，对于基因工程改良植物的耐盐性具有巨大的潜在应用价值， 为研究整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础。
【附图说明】
[0015] 图l、200mM NaCl处理不同时间对FvSnRK2. 1表达影响的柱状图；
[0016] 图2、转基因拟南芥植株PCR检测电泳图；
[0017] 图中：M、DL15000的marker ;R、阳性对照；1、为阴性对照；2~16、转基因植株； col、野生型；
[0018] 图3、200mM NaCl处理转基因拟南芥叶片0、8h、16h、24h、48h后的照片；
[0019] 图4、不同浓度NaCl处理野生型和转基因拟南芥的对比照片。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0021] 实施例
[0022] 1、实验方法与步骤
[0023] I. 1绒毛白蜡总RNA的提取
[0024] 实验中所用水均用DEPC处理4小时以上，然后高温高压灭活DEPC，所用枪头高温 高压灭菌1小时即可。
[0025] 1)研磨：在液氮预冷的研钵中加入植物组织，充分研磨，取50~IOOmg粉末加入 Iml TRIZOL(购自Invitrogen公司）中，样品体积不超过所用TRIZOL试剂体积的10%。剧 烈震荡，充分混勾。
[0026] 2)抽提：样品在室温静置5分钟以保证核蛋白复合体的完全分离，加入0. 2ml氯 仿，用力摇晃15秒，然后室温静置2~3分钟，12000g，2~8°C离心15分钟，离心后，混合 物分为三部分，底部为红色的苯酚一氯仿相，中间相，上层相为无色水相，RNA专一地留在水 相里。水相体积大约是用于匀浆化TRIZOL体积的60%。
[0027] 3) RNA沉淀：把离心后的水相转移到一个新管中，加入0. 5ml异丙醇，混匀，冰上 或-20°C静置30分钟。12000g，2~8°C离心10分钟。
[0028] 4) RNA冲洗：上步离心后去掉上清，用Iml 75%乙醇洗涤沉淀一次，7500g，2~8°C 离心5分钟，去掉乙醇，室温干燥10~15分钟（不能完全干燥否则会大大降低RNA的溶解 度）。
[0029] 5)RNA溶解：加入适量DEPC水溶解RNA(K)O %去离子的甲酰胺里也可），保存 在-70。。。
[0030] I. 2RNA质量鉴定和定量
[0031] 取1 μ L样品于1. 2%的非变性琼脂糖凝胶中电泳检测提取RNA的完整性，紫外 OD26。测定RNA样品的浓度。
[0032] I. 3cDNA第一链的合成
[0033] 利用 TaKaRa 的 Reverse Transcriptase XL (AMV)(购自 TaKaRa 公司）进行 cDNA 第一链的合成。按下列反