肠杆菌耐草甘膦基因argF、编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种肠杆菌耐草甘膦基因 argF、编码蛋 白及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因资源的获得是抗草甘膦转基因育种的关键，抗草甘膦基因可分为靶基因和非 靶基因。草甘膦在细胞中的靶标是芳香氨基酸生物合成中的关键酶5-烯醇丙酮酸-莽草 酸-3_磷酸合酶（EPSPS)，EPSPS仅在细菌和植物中存在（SteinrUcken&Amrhein，1980)， 参与莽草酸途径合成生物体所必须的芳香族氨基酸，在细胞对草甘膦的耐性中起着重要作 用。除靶基因外，抗草甘膦生物中非靶基因的研究也受到一定的关注。目前发现的非靶基因 包括C-N键氧化裂解基因，如草甘膦氧化还原酶基因 GOX ;参与裂解C-P键的C-P裂解酶；磷 酸转移酶基因 glpA、glpB和igrA，甘氨酸氧化酶基因 GO ;草甘膦N-乙酰转移酶基因 GAT使 草甘膦发生乙酰化，无法与EPSPS结合，将草甘膦转化为低毒的乙酰草甘膦；此外转运蛋白 能够主动运输某些磷酸化合物，推测草甘膦也可能被转运蛋白运出细胞外（朱金文，2008， 李亮，2010, Pollegioni, et al.，2011)。
[0003] 抗草甘膦基因被广泛应用于转基因育种研究，如Barry将细菌中获得的GOX转入 小麦获得了抗性植株（Barry，2002) Jazquez也将磷酸转移酶基因转化烟草，提高了其抗 性（Penaloza-Viizquez, et al.，1995) ;Smart等则证实过表达EPSP合酶能够提高植物的抗 性（Smart, et al.，1985);谢龙旭将抗性基因 aroAM12转入棉花得到抗草甘膦的棉花（谢 龙旭，et al.，2004,刘锡娟，2007)。在目前被挖掘的一系列抗性基因中，已被用于商业化 转基因作物中的有aroA-cp4(根癌土壤杆菌）、G0X (人苍白杆菌）、2mepsps(玉米的双突变 EPSPS)、gat (地衣芽孢杆菌）、epsps (Ag)(球形节杆菌）、mepsps (玉米的经修饰的EPSPS)、 epsps grg23ace5(人工合成的类似于epsps(Ag)的基因）。
[0004] 由于抗草甘膦转基因中除靶基因的耐草甘膦能力较强外，目前大部分挖掘的基因 耐性较弱，挖掘的基因相对较少。生物对草甘膦的抗性涉及大量调控不同层面抗性的相关 基因 （Fei et al.，2013)，因此挖掘不同层面且耐草甘膦能力强的基因对抗草甘膦转基因 育种至关重要。
[0005] 基因 argF编码鸟氨酸氨甲酰转移酶，该转移酶利用鸟氨酸合成精氨酸，在各种 生长环境中该基因都被反向调节，过多或过少的精氨酸或其他C源都会抑制argF的表达 (Voellmy&Leisinger, 1978)，该基因的下调一方面能够使鸟氨酸积累，具有抗渗透的作用， 另一方面可以帮助合成其他氨基酸如脯氨酸、芳香族氨基酸等（Weglenski，1967)。
[0006] 目前，国内外已克隆多个对草甘膦有一定抗性的突变体基因。新基因的分离和 克隆对转基因抗除草剂植物的培育及防止抗除草剂转基因植物产生交叉抗性，具有重要意 义。本发明就是从草甘膦抗性进化的肠杆菌中分离得到了具有耐草甘膦能力的基因 argF。
【发明内容】
[0007] I、发明要解决的技术问题
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供了一种肠杆菌耐草甘膦基因 argF〇
[0009] 本发明的另一个目的是提供耐草甘膦基因 argF所编码的蛋白。
[0010] 本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的重组载体。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述基因或重组载体在调控植物对草甘膦抗性及培 育耐草甘膦作物品种中的应用。
[0012] 2、技术方案
[0013] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0014] -种肠杆菌中耐草甘膦基因 argF，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。
[0015] 本发明还提供了一种耐草甘膦基因 argF所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表 Seq ID NO. 2 所示。
[0016] 进一步地，本发明提供了一种含有该耐草甘膦基因 argF的重组载体，是将耐草甘 膦基因 argF插入pMDC83植物过表达载体中而成的。
[0017] 进一步地，本发明提供了扩增所述耐草甘膦基因 argF全长或其任意片段的引物 对，该引物对的上游引物如序列表Seq ID No. 3所示，下游引物如序列表Seq ID No. 4所示。
[0018] 进一步地，本发明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重组载体在调控植物对 草甘膦抗性中的应用。
[0019] 进一步地，本发明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重组载体在培育耐草甘 膦作物品种中的应用。
[0020] 进一步地，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，就是将所述耐草甘膦基因 argF通过重组载体导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物抗草甘膦性高于所述 目的植物。
[0021] 3、有益效果
[0022] ⑴本发明所提供基因 argF的功能是参与肠杆菌耐草甘膦胁迫应答反应，过量表 达argF的拟南芥与未转基因的拟南芥相比，耐草甘膦的能力得到显著提高，表明该基因对 提高植物的耐草甘膦方面起着一定的作用。
[0023] ⑵本发明的argF可作为目的基因导入植物，提高植物耐除草剂的能力，以进行植 物品种改良，所编码的蛋白质具有耐逆功能。
[0024] ⑶利用任何一种可以导入外源基因并在植物中表达的载体，可将本发明argF基 因导入植物细胞，可获得耐草甘膦能力得以提高的转基因植物。
[0025] ⑷使用本发明的基因 argF构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上 任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及 筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因（GUS基 因、荧光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）。 从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以除草剂逆境筛选转化植 株。
[0026] (5)携带有本发明argF的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培养成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物如水稻、小麦、玉米 等，也可以是双子叶植物如大豆、黄瓜、苜蓿、番茄等。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明肠杆菌中耐草甘膦基因 argF的克隆PCR检测电泳图。
[0028] 图2为基因 argF在工程菌大肠杆菌BL21中的蛋白质表达情况分析（SDS-PAGE 图）；注：marker 从上至下分别是 116. 0KD、66. 2KD、45. 0KD、35. 0KD、25. 0KD、18. 4KD、 14. 4KD，图从左往右分别是marker、诱导前对照、诱导后菌的总蛋白、总蛋白经超声波裂解 后的沉淀、总蛋白经超声波裂解后的上清。
[0029] 图3为工程菌大肠杆菌BL21对草甘膦的耐性分析图。
[0030] 图4为转基因拟南芥T3代阳性苗（潮霉素抗性）的效果图。
[0031] 图5为转基因拟南芥T3代阳性苗argF基因插入情况的PCR检测电泳图。
[0032] 图6为转基因拟南芥耐草甘膦性状分析对比图；注：对生长了约14天的植株进行 草甘膦（终浓度〇. 5mM)的48h的处理，观察其表型。
[0033] 图7为草甘膦处理下argF在拟南芥中的表达分析图；注：对生长了约14天的植株 进行草甘膦（终浓度0. 5mM)的24h的处理，每隔6h取一次样。
[0034] 图8为基因 argF与革巴基因 aroA关系的信息学分析图。
[0035] 图9为细菌双杂中基因的westernblot验证的PCR检测电泳图；注：基因 argF编 码的蛋白大小为47KD，Marker从上至下分别是100、70、50、40、30、25KD。从图中可以看到 基因得到了良好的表达。
[0036] 图10为细菌双杂图；注：图中1为阳性对照；2、3为阴性对照；4为双杂实验。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 实施例1 :肠杆菌耐草甘膦基因 argF的克隆
[0040] (1)设计引物，提取微生物肠杆菌DNA :
[0041] 用细菌总DNA提取试剂盒（购自天根公司）提取微生物肠杆菌 (Enterobacteriaceae)的DNA，根据NCBI数据库中已有的大肠杆菌argF基因序列设计引 物进行同源克隆。扩增的引物序列为：
[0042] Seq ID NO. 3 :