提高维生素b6含量在提高水稻对于细菌性条斑病抗性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高水稻对于细菌性条斑病抗 性的相关基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病 毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：（1)病原体成功的在寄主植物内 繁殖，引起相关病症；（2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基 因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两 类：（1)抗病基因，又称R(resistanCe)基因和（2)抗病相关基因。
[0004] 根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直 接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径（Tang等，1996， Science 274:2060-2063 ;Baker 等，1997, Science 276:726-733 ;Jia 等，2000, EMBO J. 19:4004-4014;Dangl 和 Jones，2001，Nature 411:826-833 ;Nimchuk 等，2001，Curr. Opin. Plant Biol. 4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于 下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的资源有限，如目前知道 的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗 病基因也只有大约40个；（2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有 限；（3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
[0005] 抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与 合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病 原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差 异大规模地鉴定植物抗病相关基因（Maleck等，2000，Nature Genet. 26 :403-410 ;Schenk 等，2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science in China 45:449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基 因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基 因资源：（1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因 是具有持久抗性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性， 因此它们是具有广谱抗性的基因资源；（3)这类基因的资源丰富。
[0006] 植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病 反应给予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性（Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New York)、质量抗性和数量抗性（Ou 等，1975， Phytopathology 65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性（Parlevliet，1979，Annu. Rev. Phytopathol. 1:203-222)。质量抗性（或垂直抗性或完全抗性）是抗病基因介导的抗病反 应。数量抗性（或水平抗性或部分抗性）是由数量性状位点（quantitative trait locus， QTL)调控的抗病反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久（Roumen，1994, Rice Blast Disease，Zeigler 等编著，CAB International，Cambridge，UK，ρρ· 245-265)。目前，人们 对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此，虽然水稻中已经鉴定出了大量抗病〇11，如 抗白叶枯病 QTL(Li 等，1999, Mol. Gen. Genet. 261 :58-63)、抗稻瘟病 QTLCffang 等，1994， Genetics 136:1421-1434 ;Chen 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2544-2549)、抗 纹枯病 QTL (Li 等，1995, Theor. Appl. Genet. 91:382-388)和抗病毒病 QTL (Albar 等，1998， Theor. Appl. Genet. 97:1145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于水稻品种抗病性 的改良。
[0007] 近年研究发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应，提示这些 抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应 这一现象在多种植物中都被观察到，包括水稻（Xiong等，2002,中国科学45:518-526 ; Ramal ingam 等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact. 16:14_24;Wen 等，2003，Mol. Gen.Genomics 269:331-339 ;Chu 等，2004，Mol.Gen. Genomics 271:111-120)、小 麦（Faris 等，1999, Theor. Appl.Genet. 98:219-225)、豆类（Geffroy 等，2000, Mol. Plant-Microbe Interact. 13:287-296)和马铃薯（Trognitz 等，2002，Μ〇1· Plant-Microbe Interact. 15:587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因 提供了依据。
[0008] 水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因 此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减 少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。 同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通 过超量表达抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的 抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用水稻抗病基 因的克隆获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0009] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，基于提高维生素 B6含量可以提高水 稻对于细菌性条斑病抗性这一基础发现，利用强启动子驱动转基因技术，将维生素 B6合成 基因 Osroxi的超量表达载体转入水稻品种中花11，Osroxi家族基因表达量显著提高的遗 传转化水稻中维生素 B6水平显著提高，对细菌性条斑病的抗性明显增强，而Osroxi家族基 因抑制表达的遗传转化水稻中维生素 B6显著降低，对细菌性条斑病的抗性明显减弱，进而 进一步验证了维生素 B6及其合成基因 Osroxi在水稻抗细菌性条斑病中发挥重要作用及其 应用价值。
[0010] 发明人经过进一步研究后发现，提高维生素 B6含量可以提高水稻对于细菌性条 斑病抗性，而提高维生素 B6含量的各种方式均可取得上述的效果，其中可以利用超量表达 相关基因的方式来提高维生素 B6水平，同样的，也可以采用维生素 B6喷施处理、或在肥料 中直接添加维生素 B6含量来获得相同的效果，其中：
[0011] 发明人提供了一个从水稻中分离获得的水稻抗细菌性条斑病相关基因家族 OsPDXl，该基因家族包括3个成员，OsPDXL I、OsPD)(L 2和OsPDXL 3,其中：
[0012] OsPDXl. 1，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0013] OsPDXl. 2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No. 5 所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
[0014] OsPDXl. 3,其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示。
[0015] 上述三个相关基因编码的蛋白是一个维生素 B6蛋白，负责水稻中维生素 B6的从 头合成。
[0016] 发明人进而利用超表达和RNA干扰技术使目标基因在植物体内过量表达和沉默， 来鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，最终发现抑制表达任一 Osroxi家族基因的转 基因植株维生素 B6水平显著降低，对水稻细菌性条斑病的抗性水平明显降低，而超量表达 任一 Osroxi家族基因的转基因植株维生素 B6水平显著提高，抗病能力显著提高，可获得高 抗病植株。
[0017] 在上述技术的基础上，发明人采用对应的特异性引物，利用PCR技术可以从基因 组中扩增得到上述Osroxi. 1、OsPDXl. 2、Osroxi. 3基因片段，之后与合适的超表达载体连 接转入植物中去即可实现上述基因的超量表达，进而提高维生素 B6的含量，产生抗细菌性 条斑病病的转基因植物，而采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到 的。
[0018] 综上所述，本发明的发明人在国际上首次首次验证了维生素 B6及其合成基因家 族Osroxi在水稻细菌性条斑病抗性中的功能，进而利用超量表达的方式使转基因植株维 生素 B6水平显著提高，抗病能力显著提高，获得高抗病植株，具有极高的应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1.0 sPDn. UOsPDXL 2、0sPDn· 3基因完整片段在中花11基因组DNA中的PCR 分离扩增示意图；
[0020] 图中，获得用于构建超量表达载体的目的基因条带，其中Osroxi. 1基因条带大小 为957bp，OsPDn. 2基因条带大小为942bp，OsPDn. 3基因条带大小为1092bp ;
[0021] 图2. Osroxi基因抑制片段在中花11基因组DNA中的PCR分离扩增示意图；
[0022] 图中，利用引物OsroXIRNAiF/OsPDXIRNAiR扩增获得目的基因抑制表达条带大小 414bp ；
[0023] 图3.含抑制表达载体DS1301: :0sroXl的中花11遗传转化植株（CD13-22)的PCR 检测示意图；
[0024] 图中，利用引物ds 1301 S2F2/ds 1301S2R2对CD 13-22转基因植株进行检测