实施例2:核酸适配体的克隆和测序以及单链DNA二级结构的预测 一、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 1、 挑取单个DH5 a菌落，接种于3 mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜，次 日取上述菌液按比例1:100再接种于50 mL液体LB培养基中，37°C振荡2小时；当0D600 值达到0. 35时，收获细菌培养物； 2、 将细菌培养物转移到一个50 mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培养物 冷却； 3、 于4°C下4000 rpm离心10 min，弃去培养液，并将管倒置I min以使残留的培养液 流尽； 4、 各加150 μ L冰预冷的0.1 mM CaCl2溶液，合并两管，冰浴10 min ; 5、 于4°C下4000 rpm离心10 min，弃去上清液，并将管倒置I min以使残留的液体流 尽； 6、 先加入800 μ L冰预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，再加入25 μ L预冷的75%的 甘油，之后于-80 °C贮存备用。
[0019] 二、连接及连接产物的转化 1、 在微量离心管中加入0.5 yL Takara pMD19_T simple载体、4.5 yL核酸适配体 PCR产物及5 μ L的连接酶缓冲混合物； 2、 16°C反应3小时； 3、 全量（10 yL)加入至100 yLDH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟； 4、 42 °C加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟； 5、 加入37°C温浴过的LB培养基890 μ L，37°C缓慢振荡培养60分钟； 6、 取200以1^涂布于含有乂-6&1、1?16、氨苄青霉素的1^培养基上，37°(：培养16小时 以形成单菌落。
[0020] 三、核酸适配体的克隆筛选和测序以及单链DNA二级结构预测 挑取上述白色的单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C缓慢振荡培养4小时，进 行PCR扩增；扩增引物及扩增条件同前述核酸适配体的扩增条件。将经PCR确证的阳性克 隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems 3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷 酸序列的测定；结构表明，与苏丹红特异性结合的核酸适配体(命名为C07)其序列自5'端 至3'端为： tgctagacga tattcgtcca tccggcggca tccgacgctg tgaccggggc tagacccttg cccgctgtca gactgaatat gtca 与苏丹红特异性结合的核酸适配体C07的序列长度：84个碱基，序列类型：核酸，链数： 单链，拓扑学：直链状，序列种类：ssDNA。
[0021] 通过MFOLD软件设置温度为26 °C、Na+浓度为150 mM，Mg 2+浓度为I mM (http://mfold.rna· albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)和 QGRS 映射（http:// bioinformatics, ramapo. edu/QGRS/analyze. php)对与苏丹红特异性结合的核酸适配体 C07单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，适配体含有突出的环和茎，其吉布斯自由 能DG=-14. 40,该结构具有较高的稳定性。
[0022] 实施例3:圆二色谱法对K +浓度与核酸适配体C07的关系的探究 1.将适配体用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7. 2)稀释至20 μ M后，于94°C变性 0· 5 min以0· 5°C /min的速度冷却至25°C。
[0023] 2.用含有不同浓度（0、5、10、20、50 mM) KCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7. 2)将核酸适配体C07稀释至2. 5 μ Μ。
[0024] 3.于25 ° C，220 - 340 nm波长处用圆二色谱仪进行检测（结果见图1)，结果显 示核酸适配体C07在不同溶液中均有275nm处的峰值出现，说明该核酸适配体具有茎环和 G-四链体结构。
[0025] 实施例4:核酸适配体（C07)的特异性和对苏丹红的敏感性 一、核酸适配体C07特异性检测 UELONA方法 在传统的ELISA方法的基础上加以改进，用筛选出来的适配体来代替抗体，采用生物 素-亲和素放大系统用以检测待测样品的一种方法。
[0026] (1)适配体-生物素的包被 筛选出来的特异性识别苏丹红的核酸适配体送到TaKaRa公司合成，得到用生物素标 记的适配体。使用时先短暂离心，使生物素标记的适配体聚集在试管底部。根据说明书， 用灭菌水或TE buffer (pH7. 5-8. 0)充分溶解成存储溶液，一般浓度为10 4或10 5M,置 于-20°C保存。为避免反复冻融，可分装成小份。将生物素标记的适配体用IXPBS稀释到工 作浓度，每个孔加100 yL，用不干胶或封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h， 孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min， 每次都要在干净的吸水纸上拍干。
[0027] (2)加苏丹红孵育 按核酸适配体结合缓冲液与苏丹红体积比1:1的比例加入到包被有生物素标记的适 配体的酶标板中，每个孔加100 μL，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h， 孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min， 同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干。（对照组则将苏丹红换成非靶标蛋白，方法同上)。
[0028] (3)加酶结合物孵育 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡 器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min。
[0029] (4)显色 每孔加入TMB100 yL，于37°C避光显色10 min，拍照保存。
[0030] (5)终止 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处吸 光度值0D450。
[0031] 结果显示，适配体C07能够与苏丹红特异性的结合(结果见图2)。
[0032] 2、Dot Blot 方法 (1)将5微升的苏丹红（40 ng/ μ L)点至圆形NC膜（半径为0· 25cm)中心，待NC膜 干燥后，置于2mL的冻存管，同时设立空白对照和阴性对照。
[0033] (2)加入100微升封闭液，与37°C孵育2h。用含0· 05% Tween-20的PBS溶液洗 膜3次，每次3min。
[0034] (3)将制备好的标记有生物素的配体于95°C变性5min，迅速降至4°C。将适配体 加到制备好的NC膜上，37°C孵育2h后，用含0. 05 % Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次 3min〇
[0035] (4)将辣根过氧化物酶结合物加到NC膜上，37°C孵育Ih后，用含0. 05% Tween-20 的PBS溶液洗膜3次，每次3min。
[0036] (5)加入TMB到NC膜，于37°C避光显色10 min，观察适配体与苏丹红的结合情况， 拍照保存(结果见图3)，适配体C07能够与苏丹红特异性的结合。
[0037] 二、核酸适配体C07最佳浓度的检测 1、 将生物素标记的适配体用IX PBS稀释到不同的工作浓度，每个孔加100 μ L，用不 干胶或封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加 洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍 干； 2、 按适配体结合缓冲液与40 ng/ μ L的苏丹红溶液体积比1:1比例加入到包被有生物 素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μ L，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡器上 孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次， 每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振 荡器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMB100 μ L，于37°C避光显色10 min; 5、 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处 吸光度值0D450 ; 6、 结果表明，适配体C07的最佳浓度为100 nM (结果见图4)。
[0038] 三、核酸适配体C07对苏丹红的灵敏度的检测 1、 将生物素标记的适配体用IXPBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μ L，用不干胶或 封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液 200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍干； 2、 按适配体结合缓冲液与不同浓度的苏丹红溶液体积比1:1比例加入到包被有生物 素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μ L，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡器上 孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次， 每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振 荡器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMB100 μ L，于37°C避光显色10 min; 5、 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处 吸光度值0D450 ; 6、 结果表明，适配体C07能检测到苏丹红的最低浓度为4 ng/yL (结果见图5)。
【主权项】
1. 一种与苏丹红特异性结合的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. 根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于：其二级结构具有突出的环和茎，且存 在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14. 40。3. 权利要求1所述核酸适配体在识别苏丹红或在制备检测苏丹红的试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合苏丹红的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，且存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.40；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到苏丹红。
【IPC分类】C12N15/115, G01N33/53
【公开号】CN105177010
【申请号】
【发明人】韩芹芹, 汪颖, 乔璞, 宋玉竹, 张金阳, 陈强
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月10日