目的片段，纯 化DNA。然后连接到pMD18-T(购自TaKaRa公司）载体用于测序，将该片段的序列与基因序 列进行拼接，获得AaTPS7基因上游约I. Ikb的片段。
[0043] 表3第二轮PCR反应体系
[0044] CN 105177007 A 说明干ι 5/8 页
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[0048] 其中，所示序列的正义链即与SEQ ID No :1所示的序列一致。
[0049] 实施例2
[0050] 分析得到的AaTPS7基因启动子的顺式作用元件，确定AaTPS7基因启动子的类型
[0051] 本发明中得到的AaTPS7基因启动子序列长度为1167bp。为了寻找启动子上的顺 式作用元件，用 Plantcare (http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/ html/)对AaTPS7基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上具有除了 TATA box和 CAAT box，还具有很多顺式作用元件：CGTCA-motif、HSE、MBS、MRE、TC-richRpeats、 WUN-motif 等。
[0052] 启动子序列中顺式作用元件见表4 :
[0053] 表4 :启动子序列中调控元件分析
[0054] CN 105177007 A 说明书 7/8 页
[0055] 表4中，-980、-907、-678和-130的位置参见实施例1中列出的序列中的相应位 置。
[0056] CGTCA-motif是茉莉酸甲酯应答元件；HES响应热胁迫；MBS、MRE是MYB结合位点； TC-rich repeats是植物进行防御，响应干旱胁迫的元件；WUN-motif收到机械损伤诱导。 以上结果分析表明，AaTPS7基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。
[0057] 实施例3
[0058] 将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合⑶S报告基因
[0059] 为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaTPS7基因的启 动子proTPS7连接pCAMBIA-1391z载体融合⑶S报告基因，为了实现对表达载体 pCAMBIA1391z-proTPS7的构建，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切 位点，引物序列如下表所示：
[0060] 表 5 PcAMBIAl39Iz-ProTPS7 载体构建 PCR 引物
[0062] 实施例4
[0063] 将构建好的pCAMBIA1391z-proTPS7载体转化根癌农杆菌并检测
[0064] 将含有构建完成的植物表达载体转入根癌农杆菌（EHA105)，并进行PCR验证。结 果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而 获得含基因启动子和⑶S基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-pr〇TPS7的根癌农杆菌 菌株。
[0065] 实施例5
[0066] 将带有pCAMBIA1391z-proTPS7载体的根癌农杆菌转化青蒿
[0067] 1)外植体的预培养
[0068] 青蒿种子用体积分数为75 %的乙醇浸泡Imin ;再用20 % (w/v)的NaClO浸泡 20min ;无菌水冲洗3~4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS培养基中， 该MS培养基为Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过 商业渠道获得；25°C、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至 5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
[0069] 2)农杆菌与外植体的共培养
[0070] 将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100 μ mol/L AS (乙酰丁香酮）组成的共培养 培养基中，滴加含活化好的上述植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植 体与菌液充分接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体 培养基悬液的叶片外植体为对照；
[0071] 3)抗性再生植株的筛选
[0072] 将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到MS、0. 5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤）、 0· 05mg/L NAA(萘乙酸）、50mg/L Kan (卡那霉素）和500mg/L Cb (羧苄青霉素）组成的发 芽筛选培养基上，于25°C、16小时的日光（light)和8小时的黑暗（dark)中培养，每两周 继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下 转入1/2MS。（无激素的MS培养基）和125mg/LCb组成的生根培养基上培养至生根，从而获 得Kan抗性再生青蒿植株。
[0073] 实施例6
[0074] UPCR检测转基因植株
[0075] 根据表达盒promoter-GUS中的promoter和⑶S序列分别设计正向引物（proT PS7:5' -GGTAAITTGCCCTTATTAATTCGCA-3'）和反向引物（⑶SR:5' -GACATCGGCTTCAAATGGCG TA-3'）对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片 段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，结果如图1所示。这表明， 该转基因植株中包含了表达盒promoter-GUS。
[0076] 2、启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
[0077] 对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行⑶S组织染色，结果如图2所示，结 果表明，染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明AaTPS7基因启动子在转基因 青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的pr〇TPS7基因启 动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
[0078] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸 序列如SEQIDNo:1所示。2. -种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在 于，所述启动子上的顺式作用元件包括：CGTCA-motif、HSE、MBS、MRE、TC-rich r印eats、 WUN-motif〇3. -种制备如权利要求I所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其 特征在于，包括以下步骤： 步骤一、从青蒿基因组中克隆所述启动子的基因组序列； 步骤二、分析所述启动子上的顺式作用元件，确定所述启动子类型； 步骤三、将步骤一中获得的所述启动子的序列与载体连接； 步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌； 步骤五、将步骤四中获得的带有所述载体的所述根癌农杆菌稳定转化植物； 步骤六、检测所述启动子的转入，并确定所述启动子所引导的基因在植株中的表达部 位。4. 如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启 动子的方法，其特征在于，所述步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩 增所述启动子序列。5. 如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表 达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤三中的载体为PCAMBIA13 91z，利用引物对 1391z-proTPS7-F和1391z-proTPS7-R，通过PCR在获得的所述启动子序列中引入酶切位点 PstI和Ncol，从而连接到载体pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示： 1391z-proTPS7-F:5' -AACTGCAGAAGAGAAAGCTACATACAATGGGAA-3' ； 1391z-proTPS7-R:5' -CATGCCATGGGGAGAAAGATCGGTTATGC-3'。6. 如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启 动子的方法，其特征在于，所述步骤五包括： 1) 外植体的预培养； 2) 农杆菌与外植体的共培养； 3) 抗性再生植株的筛选。7. -种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在非分泌型 腺毛中表达的启动子。8. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括如权利要求1所述的调控基因在非分泌 型腺毛中表达的启动子。9. 一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子用于利用植物 腺毛组织表达和在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。10. -种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在非分泌型腺 毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控研究中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示。本发明还提供了该启动子的制备方法，含有该启动子的载体和表达盒。本发明提供的启动子可以在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，可以在生产代谢产物的基因工程育种中的进行应用。因此，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/84, C12N15/113, A01H5/00
【公开号】CN105177007
【申请号】
【发明人】唐克轩, 陈俏, 沈乾, 付雪晴, 石璞, 孙小芬, 颜廷祥
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月30日