山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及山核桃miR171d在延迟植物花期或植物 叶片发育中的应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体，经过 Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（18-25个核苷酸）。miRNA通过在转录水平或 者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表 达中起负调控其靶基因作用。miRNA在植物从成花诱导到花器官特征属性形成的整个花发 育过程均发挥着关键作用。
[0003] 山核桃（Carya cathayensis Sarg.)属胡桃科山核桃属植物，雌雄同株，主要分布 于浙江西部地区以及安徽地区，是我国特有的名优干果和木本油料树种，是山区农民脱贫 致富的重要途径；然而，山核桃从种子播种到结果需要10余年的时间，从而较大程度抑制 了山核桃的产量，如何缩短童期促进早实是山核桃研究者亟待解决的难题。
[0004] 模式植物miR171d的相关功能研究很早就有报道。2002年David P. Bartel等从拟 南芥幼苗和花中分别克隆了大量的小RNAs，Nor them分析发现ath-mi Rl 71 d在花中表达量 较高；2002年James C. Carrington等的研究发现，miR171d在拟南芥、水稻和烟草的花中积 累量相对比较高，而在叶和莖杆中表达量较少或不能被检测到；2005年Vincent L Chiang 等发现miR171d在毛果杨茎杆中特异表达，可能参与了木质组织的形成，木质组织机械损 伤胁迫导致ptr-miR171d下降；miR171d在小麦的各种组织中都有表达，特别是根中相对较 高（孙其信，2007) ;2009年薛红卫等对水稻miRNA做了表达谱分析，得出osa-miR171dg/h 在水稻根中选择性优先表达。可见miR171d在不同植物的各个组织中表达及功能是有差异 的。山核桃miR171d的功能作用尚未知晓。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。
[0006] 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用，所述山核桃miR171d 的喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0007] 优选地，所述植物是拟南芥或烟草。
[0008] 优选地，所述植物是拟南芥。
[0009] 获得山核桃miR171d转基因植株的具体方法包括：将包含所述山核桃miR171d的 前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。 [0010] 由于山核桃成熟miR171d本身序列很短，只有21bp，而其前体序列相对较长，连接 到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 本发明提供了山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。应用山 核桃miR171d，有望人为地调控植物的花期或叶片发育，具体地，有望人为地调控山核桃的 花期或叶片发育。
【附图说明】
[0012] 图1为山核桃花芽的总RNA
[0013] 图2为山核桃miR171d前体的中间载体菌液PCR检测
[0014] 图3为山核桃miR171d前体的表达载体菌液PCR检测
[0015] 图4为山核桃miR171d转基因拟南芥植株的抗性筛选
[0016] 图5为山核桃miR171d转基因拟南芥的PCR检测
[0017] 图6为野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥的叶片数 目统计
[0018] 图7为观察到的野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥 叶片的表型
[0019] 图8为观察到的野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥 的表型
【具体实施方式】
[0020] 1.材料
[0021] 1.1实验材料
[0022] 山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树进行采样。样品 采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80°C冰箱保存待用。另外，购买转了拟南芥 miR171d的拟南芥突变体种子（购于美国ABRC)。
[0023] L 2实验试剂与仪器
[0024] DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物 工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
[0025] 1.3引物合成及测序
[0026] 引物合成及测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0027] 2.方法
[0028] 2. 1山核桃花芽总RNA的提取
[0029] 采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：
[0030] (1)在IOmL离心管中加入3mL 65°C预热的CTAB提取缓冲液（10% CTAB，10% PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8. 0)，5M NaCl，0.6M EDTA (ρΗ8·0))，加入 200 μLβ-巯基乙醇；
[0031] (2)取-70°C保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0032] (3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65°C水浴30min， 期间振荡3-4次；
[0033] (4)在混合物中加入等体积的25:24:1 (酸性饱和酚：氯仿：异戊醇），约3ml。混 合均勾后HOOOrpm离心10min (常温）；
[0034] (5)取上清转入新的IOml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)上下颠倒 混勾，12000rpm4°C离心10min后取上清；
[0035] (6)重复步骤4 一次，直至中间层消失；
[0036] (7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于_20°C冰箱冷冻 30min。12000rpm4°C离心10min弃掉上清，沉淀加入65°C预热好的SSTE400 yL溶液至全 溶；
[0037] (8)溶液中加入ImLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200 μ L氯仿摇匀，室温 静置 2_3min ;
[0038] (9) 4? 12000rpm 离心 15min ;
[0039] (10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置IOmin ;
[0040] (11) 4°C 12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
[0041] (12)加入ImL预冷的75%乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4°C离心5min，弃掉上 清；
[0042] (13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min ;加入适量DEPC水溶解沉淀，-80°C 保存备用。
[0043] 2. 2cDNA 合成
[0044] 使用 TAKARA试剂盒Prime ScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内 容如下：
[0045] (1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系：
[0047] (2) 65 °C保温5min，冰上迅速冷却。（模板RNA变性）
[0048] (3)再次配置反应体系如下：
[0050] (4)缓慢摇匀。
[0051] (5) 42 °C 反应 30-60min。
[0052] (6) 95°C 5min酶失活后，冰上冷却。
[0053] 2. 3前体序列的引物设计
[0054] 依据前体序列：CTTCAGCTATCACTGCATGGTATTTTTCTTTCAACCTAGCTAGCTTCTTGTTGATT TCTTCTTTTTATCATCGAGTCTTTTTACTTTGATCCTCCGAAATATATGTAGCTTTTGCATATATATATATATGTTC CTTCATGGCCGTGTTCATGATCATTGGGAATACGTGCAAGAAGATCAGGGATTCCAGGAGTATACATATGTGAAATA GCTACTTTGATATTGGCCTGGTTCACTCAGACGAAAAACAAAGCAGTCAATGGGGAGTGTACGTCACTAGCTTTTCT TTTCTTTTCTAATTTGATTGAGCCGTGCCAATATCTCAGTGCTCTTTCATTTCTTCCGGACTCTCATCACTACAATA CTTGAGGCCGAGATCAACATACCAATCAAAACGTTTGATAATTTATCTTCGATAATGGGAAAATTAGTTTCATTATA TATGCGTTGTGGGCTTCATTTGTTATTAATCTCATGCAGTTTTTCTATTTGATTATTCATGAGTTCTCATGCAGCAA AGAAGGTGCTGCTTTTGGCTTCAGC，使用Primer Primer 5. 0设计引物，引物两端分别加上酶切 位点 KpnI 和 Xbal，正向引物：5' -GGGGTACCGCTAGCTTCTTGTTGATTTC-3'，反向引物：5' -GCT CTAGATAATAACAAATGAAGCCCAC-3' 克隆所需序列。
[0055] 2. 4PCR扩增反应
[0056] 以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：
[0058] PCR 反应条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin。 30个循环后，72°C延伸lOmin。PCR反应完成后4°C暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进 行调整。
[0059] 2. 5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
[0060] 将PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐， ImM EDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的 DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
[0061] (1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术 刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入I. 5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过 400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴 露时间来降低对DNA的损伤。
[0062] (2)根据胶块的质量和浓度，每IOOmg琼脂糖加300~600 μ L的比例加