山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及在降低植物重金属胁迫耐受性中的应 用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA (miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体，经过 Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（18-25个核苷酸）。miRNA通过在转录水平或 者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表 达中起负调控其靶基因作用。
[0003] 在已知的众多参与植物抗逆过程的miRNA中，miR398a是第一个被发现受逆境胁 迫负调控的miRNA。miR398a靶向两种Cu/Zn过氧化物歧化酶（CSD):细胞质CSDl和叶绿 CSD2。CSD是植物抵御活性氧（ROS)毒害的主要超氧化物歧化酶（SOD)，这暗示miR398a可 能在氧化胁迫响应中发挥作用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用。
[0005] 山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用，所述山核桃miR398a的 喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0006] 优选地，所述重金属是Cu2+或Zn 2+。
[0007] 优选地，所述植物是拟南芥或烟草。
[0008] 优选地，所述植物是拟南芥。
[0009] 获得山核桃miR398a转基因植株方法包括：将包含所述山核桃miR398a的前体基 因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥，筛选、培养和获得转基因株系。
[0010] 由于山核桃miR398a本身序列很短，只有21个bp，而其前体序列相对较长，连接到 载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本发明公开了山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用。通过敲除 山核桃的miR398a基因，有望增强山核桃的重金属胁迫的耐受性，并使研究人员进一步了 解植物受金属胁迫的耐受性。
【附图说明】
[0012] 图1为山核桃花芽的总RNA
[0013] 图2为山核桃miR398a前体的中间载体菌液PCR检测
[0014] 图3为山核桃miR398a前体的表达载体菌液PCR检测
[0015] 图4为山核桃miR398a转基因拟南芥植株的抗性筛选
[0016] 图5为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的叶绿素荧光测定图
[0017] 图6为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的叶绿素荧光测定指标：A非光 化学淬变；B光化学淬变；C电子传递速率D PSII原初光化学效率；E有效量子产量
[0018] 图7为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的保护酶测定指标：A过氧化氢 酶活性；B过氧化物岐化酶活性；C超氧化物岐化酶活性
【具体实施方式】
[0019] 1.材料
[0020] I. 1实验材料
[0021] 山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树进行采样。样品 采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80°C冰箱保存待用。
[0022] 1. 2实验试剂与仪器
[0023] DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物 工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
[0024] 1.3引物合成及测序
[0025] 引物合成及测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0026] 2.方法
[0027] 2. 1山核桃花芽总RNA的提取
[0028] 采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：
[0029] (1)在IOmL离心管中加入3mL 65°C预热的CTAB提取缓冲液（10% CTAB，10% PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH 8.0))，加入200 μLβ-巯基乙醇；
[0030] (2)取_70°C保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0031] (3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65°C水浴30min， 期间振荡3-4次；
[0032] (4)在混合物中加入等体积的25:24:1 (酸性饱和酚：氯仿：异戊醇），约3ml。混 合均勾后HOOOrpm离心10min (常温）；
[0033] (5)取上清转入新的IOml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)上下颠倒 混勾，12000rpm4°C离心10min后取上清；
[0034] (6)重复步骤4 一次，直至中间层消失；
[0035] (7)上清转移至I. 5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于_20°C冰箱冷冻 30min。12000rpm4°C离心10min弃掉上清，沉淀加入65°C预热好的SSTE400 yL溶液至全 溶；
[0036] (8)溶液中加入ImLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200 μ L氯仿摇匀，室温 静置 2_3min ;
[0037] (9) 4。〇 12000rpm 离心 15min ;
[0038] (10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置IOmin ;
[0039] (11) 4°C 12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
[0040] (12)加入ImL预冷的75%乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4°C离心5min，弃掉上 清；
[0041] (13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min ;加入适量DEPC水溶解沉淀，-80°C 保存备用。
[0042] 2. 2 cDNA 合成
[0043] 使用 TAKARA 试剂盒 Prime ScriptTM II 1st Strand cDNASynthesis Kit，详细内 容如下：
[0044] (1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系：
[0046] (2) 65 °C保温5min，冰上迅速冷却。（模板RNA变性）
[0047] (3)再次配置反应体系如下：
[0049] (4)缓慢摇匀。
[0050] (5) 42 cC 反应 30-60min。
[0051] (6)95°C 5min酶失活后，冰上冷却。
[0052] 2. 3前体序列的引物设计
[0053] 依据山核桃的 miR398a 前体序列：ACGGAAGTACTGAGGTGTAGTACATTTTTTTAGGTAAAGT ACTGATTTAAAAGTGTTGCTGTGGCTATATAACATGGAATATCTTTCTCCATTGGCATCACCAGATTGTGGGGAAAG AGGCAAGAAAGTCGTGTAAATTAAAGGTGGATGAGCCTTACAGGGGCAACATGAGATCACATGTGGGCATTCTTATT ATTCACATGACACCCTTTCTGCTTGTGTTCATGTGTCCTATAGACTACAAATGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCAGGA CTTTCCTCCACCGCATGATCATGATCATGGTGATGCAATCGGCTTGATGGTTTTAAGCTGGCAATAATCATAGCTTA ATAGCCAGGTCAGCAAGGTCATCTTCCCCAACTCCTTTCCAAATCCCACCGATCATGAGATGGCCTTTGACACTACT TTCCTTTAATGGATTTCTCTTGCTGGGTGAGAAGGTCTGTCACAGATGCGAT，使用 Primer Primer 5. 0 设 计引物，引物两端分别加上酶切位点KpnI和Xbal，正向引物：5'-GGGGTACCAATATCTTTCTCCA TTGGCATC-3' 反向引物：5' -GCTCTAGAATCGCATCTGTGACAGACCTTC-3，，克隆所需序列。
[0054] 2. 4 PCR扩增反应
[0055] 以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：
[0058] PCR 反应条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin。 30个循环后，72°C延伸lOmin。PCR反应完成后4°C暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进 行调整。
[0059] 2. 5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
[0060] 将PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐， ImM EDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的 DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
[0061] (1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术 刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入I. 5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过 400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴 露时间来降低对DNA的损伤。
[0062] (2)根据胶块的质量和浓度，每IOOmg琼脂糖加300~600 μ L的比例加入Buffer B2〇
[0063] (3)置于55°C金属浴lOmin，期间混匀2~3次直至胶块完全溶化为止。
[0064] (4)当目的片段< 500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若 彡500bp，则此步骤可以省略。
[0065] (5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8, OOOxg离心30s。倒掉收集管中的液体，并 将吸附柱放入同一个收集管中。
[0066] (6)加入500 μ L Wash Solution，9000xg离心30s。再次倒掉收集管中的液体。
[0067] (7)重复一次步骤6。
[0068] (8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离lmin。扔掉收集管，并将吸附 柱置于灭过菌的I. 5mL EP管中。
[0069] (9)打开吸附柱的盖子，室温放置lOmin。为了去除残留的酒精，否则会严重影响 回收得率和后续实验结果。
[0070] (10)在吸附膜中央加入15-3(^1^(1(1!120。室温静置51^11，900(^离心11^11。1.51^ EP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20°C保存。
[0071] 2. 6 DNA回收片段与PMD-19