一种抑制Survivin基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制Survivin基因表达的双链SiRNA分 子及其应用。
【背景技术】
[0002] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)现象最初发现于植物和线虫当中是指内源或 外源性的双链RNA分子导致细胞内特定基因表达的沉默。通过导入外源SiRNA分子（即 SiRNA递送）可以对细胞内目的蛋白的表达水平进行调控。当被下调的蛋白为疾病相关蛋 白时，RNAi就有可能成为一种新的治疗策略。在肿瘤、感染和糖尿病等疾病的治疗中，RNAi 已经成为国际上的研究热点之一。
[0003] Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于 肿瘤和胚胎组织，特别是在肺癌细胞和乳腺癌上高度表达，且与肿瘤细胞的凋亡密切相关。 Survivin主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：①直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和 Caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；②Survivin与周期蛋白激酶相互 作用阻断凋亡信号转导通路。
[0004] 在肿瘤治疗过程中，耐药性是困扰医生的一大难题，因此，设计一种双链SiRNA分 子，导入生物体内后，既能特异高效地沉默相应的Survivin基因，又能改善机体的耐药状 态，对肺癌和乳腺癌的治疗提供了指导意义。
【发明内容】
[0005] 为了解决目前癌症治疗的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，并最终完成本 发明。
[0006] 因此，本发明的一个目的是提供一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子， 该双链siRNA分子既可以特异高效地抑制Survivin基因的表达，又能改善机体的耐药状态 本发明的另一个目的是提供上述双链siRNA分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 在本发明的一个方面，提供了一种抑制Survivin基因表达的siRNA，其由正义链 和反义链组成，其中，
[0009] 所述正义链的序列为：5' -GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3'（SEQ ID NO. 1);
[0010] 所述反义链的序列为：5'-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0011] 在本发明的siRNA的序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖 核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，dT(或表示为t)表示胸腺嘧啶脱氧核糖 核苷酸。
[0012] 在本发明的另一个方面，提供了上述双链siRNA分子在制备治疗肿瘤的药物中的 应用。
[0013] 本发明中，优选地，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。
[0014] 上述双链SiRNA分子能够用于制备治疗肿瘤（特别是，肺癌和乳腺癌）的药物。
[0015] 由于survivin是一种凋亡抑制蛋白，与肿瘤细胞的凋亡有关，当该SiRNA双链序 列进入到生物体内时，能够高效抑制survivin基因的表达，诱导癌细胞的凋亡，达到治疗 癌症的目的。双链siRNA分子能够用于制备治疗肺癌和乳腺癌的药物。本发明的积极效果 在于：提供了一种新的高效革G向survivin基因的双链siRNA分子，同时还能改善机体的耐 药状态，对肺癌和乳腺癌的治疗提供了指导意义。
【附图说明】
[0016] 图1是显示Western Blot检测肿瘤细胞中转染双链siRNA分子后survivin蛋白 表达水平的图；
[0017] 图2是显示荧光定量PCR检测肿瘤细胞中转染双链siRNA分子后survivin mRNA 表达水平的图； 图3是实施例10中的显影结果。
【具体实施方式】
[0018] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。然而，这些 实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019] 实施例1 :一种抑制Survivin基因表达的siRNA的化学合成
[0020] 根据survivin基因的核苷酸序列，设计小分子干扰siRNA :
[0021] 正义链：5，-GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3，（SEQ ID NO. 1)
[0022] 反义链：5，-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3，（SEQ ID NO. 2)
[0023] 将该序列在人类EST数据库中比对，确定没有与它相同的其它基因序列。siRNA由 广州锐博生物科技有限公司合成。该siRNA序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷 酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，t表示胸腺嘧啶脱氧核糖 核苷酸。
[0024] 实施例2 :MCF-7乳腺癌细胞的活化与复苏
[0025] 将MCF-7乳腺癌细胞（购自ACTT)冻存管从液氮中取出，迅速将冻存管投入到 37°C的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。溶化后，用酒精棉球 擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。将MCF-7细胞转移至15ml离心筒中，将IOml DMEM 完全培养基加入到装有MCF-7细胞的离心筒中，lOOOrpm，离心5min，弃上清，再次加入新鲜 的完全培养基重悬细胞，将重悬后的细胞分装到细胞培养瓶中，置于37°C、5% CO2培养箱 培养，次日更换新鲜培养基，待细胞长至占细胞培养瓶底部70 %~80 %，即可进行消化传 代。
[0026] 实施例3 :MCF_7乳腺癌细胞的传代
[0027] 当MCF-7乳腺癌细胞密度达到70%~80%时，在超净台中，将培养瓶中的培养基 倒掉，用PBS溶液洗两次后，加入胰蛋白酶lml，置于37°C培养箱中消化3~4min，待细胞变 圆，敲打培养瓶底部，使贴壁细胞全部变成悬浮状态，加入1ml的完全培养基终止消化。吹 打细胞使其成为悬浮单个细胞，取一定量的细胞悬液放回至细胞培养瓶中继续培养。
[0028] 实施例4 :MCF_7乳腺癌细胞的转染
[0029] 将约2 X IO5个的MCF-7细胞悬液接种到两个6孔板中，在37°C、5% CO 2培养箱细 胞培养24小时后，用lipofectame2000将siRNA-lipo2000混合液进行转染，使siRNA的最 终浓度分别为1〇ηΜ、20ηΜ、30ηΜ，同时设置一组空白对照组（Control)。对于每个转染样品， 按如下步骤准备siRNA-Ιipo2000混合液：
[0030] a.稀释实施例1中合成的siRNA :用50 μ 1不含血清培养基〇pti-MEM:_稀释5， 10,15pmol SiRNA (加入细胞中的SiRNA终浓度分别为10nM、20nM、30nM)，轻轻混匀，室温孵 育 5min ;
[0031] b.稀释lipo2000 :用50 μ 1不含血清培养基〇P丨i-MEM?稀释1 μ I lip〇2000,轻 轻混匀并室温孵育5min ;
[0032] c.将步骤a与步骤b得到的液体轻轻混勾，室温孵育20min，得到siRNA-lipo2000 混合液。
[0033] d.转染：将siRNA-lipo2000混合液加入含有MCF-7细胞以及培养液的培养板各 孔中，轻轻混匀；
[0034] e将培养板置于37 °C的CO2培养箱中培养48h，培养4h后，可以将孔里含有 siRNA-lipo2000混合液的