缺失型和α2变异的试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于水解探针法的可同时检测地中 海贫血-α21·9缺失型和α 2变异的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常 见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有Cl-地贫和β-地贫。中国人群中，α-地贫 的基因型常见的为缺失型一SEA、-α3·7和-α 4Λ 2013年，钦州市妇幼保健院检测出了一种 命名为'钦州型α地贫缺失型'的罕见地贫基因型，由于该基因型的分子生物学机制为α 珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中一段21.9kb的DNA序列的缺失，因此简写为-a2L9(Long J, Yan S, Lao K, Pang ff, Ye X, Sun L. The diagnosis and molecular analysis of a novel 21.9kb deletion (Qinzhou type deletion)causing a +thalassemia.Blood Cells Mol Dis. 2014 ;52(4) :225-9.)。此外，在申请人的研究过程中，还发现一种新 型的α-珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC。申请人还发现该基因型在广西有一定的分布几率，为对这 两种基因型进行检测，需要建立一种可以同时和快速检测HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因- α 21·9等位基因的试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的可同时检测地中海 贫血-α21·9缺失型和α2变异的试剂盒。该试剂盒可以实现单管单次反应直接完成 ΗΒΑ2: c. 301-24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和 准确性，以及较高的特异性。
[0004] 本发明所述的基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α 21·9缺失型和α 2变异 的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其中：
[0005] 所述α2变异为α-珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中α2基因的变异基因型，该 基因型被描述为HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC，序列具体为：
[0006] gggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctc tgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacg cctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagcc gttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaag tctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgt ctcagaccaagga ；
[0007] 所述的扩增引物为：一对可以扩增α -珠蛋白基因簇中-α 21·9等位 基因的特征序列的引物21. 9-F和21. 9-R，一对可以扩增α -珠蛋白基因簇中 HBA2: c. 30l-24deIinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，以及一对可以 扩增内参基因 GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R ;
[0008] 所述的荧光探针为：一条特异性检测21. 9-F和21. 9-R扩增产物的荧光探针 21. 9-Prob，一条特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob，一条特异性检 测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob ;
[0009] 其中：
[0010] 所述可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α 21·9等位基因的特征序列的引物对中，
[0011] 21. 9-F :5' -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3' ；
[0012] 21. 9-R :5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3' ；
[0013] 所述可以扩增α -珠蛋白基因簇中ΗΒΑ2 :c. 301_24delinsCTCGGCCC等位基因的特 征序列的引物对中，
[0014] A2V-F :5'-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3' ；
[0015] A2V-R :5'-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3' ；
[0016] 所述可以扩增内参基因 GAPDH片段的引物对中，
[0017] GAPDH-F :5,-CCCCACACACATGCACTTACC-3,；
[0018] GAPDH-R :5,-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3,；
[0019] 所述特异性检测21. 9-F和21. 9-R扩增产物的荧光探针21. 9-Prob为：
[0020] 21. 9-Prob :5, -6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3,；
[0021] 所述的特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob为：
[0022] A2V-Prob :5' -6-R0X-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3' ；
[0023] 所述的特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob为：
[0024] GAPDH-Prob :5, -CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3, 〇
[0025] 本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花 青染料分子5, BHQ-I和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
[0026] 本发明所述的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶 液、MgCljP dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体 系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStar Taq DNAPolymerase配套的缓冲液。
[0027] 采用上述试剂盒快速检测HBA2 :c. 301_24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的 方法，包括以下步骤：
[0028] 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
[0029] 2)配制反应体系，具体为：
[0030] 将引物 21. 9-F、21. 9-R、A2V-F、A2V-R、GAPDH-F 和 GAPDH-R，荧光探针 21. 9-Prob、 A2V-Prob和GAPDH-Prob ;以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体 系；
[0031] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多 少）；
[0032] 4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果，当CY5通道有Cq值读数，则该样本被正常扩增；
[0033] 在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道有读数，则表示该样本携带 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0034] 在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道没有Cq值读数，则表示该样本不携带 HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC 等位基因；
[0035] 在CY5通道有读数的前提下，若FAM通道有Cq值读数，则表示该样本携带-α 21·9等位基因；
[0036] 在CY5通道有读数的前提下，若FAM通道没有Cq值读数，则表示该样本不携 带_α21·9等位基因。
[0037] 上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。
[0038] 上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA :1~3ng/ yL ;各引物：0. 3~0. 5ymol/L ;各荧光探针浓度为0. 3~0. 5ymol/L ;DNA模板：20~ 200ng ;镁离子：1. 5~I. 9mmol/L ;反应体系的终体积优选为20 μ L。
[0039] 上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95°C预变性8~12分钟，然后95°C 15~ 30秒，60 °C退火50~70秒，39~49个循环，于60 °C退火步骤末采集荧光信号。
[0040] 与现有技术相比，本发明的特点在于：
[0041] 1、本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应直接完成 HBA2: c. 301-24delinsCTCGGCCC和-α 21·9等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和 准确性，以及较高的特异性。
[0042] 2、无需开管操作，极大限度地降低了实验室PCR产物污染的可能；
[0043] 3、采用水解探针的实验方案比现有其他方法所需时间少，对设备要求也不高。
【附图说明】
[0044] 图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；
[0045] 图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线；
[0046] 图3为本发明实施例1中3#样本的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于以下实施例。
[0048] 实施例1 :采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
[0049] 1、试剂盒的组成：
[0050] (1)可以扩增α -珠蛋白基因簇中-α 21·9等位基因的特征序列的引物对21. 9-F和 21. 9-R ：
[0051] 21. 9-F :5'-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3'（SEQ ID NO :1);
[0052] 21. 9-R :5,-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'（SEQ ID NO :2);
[0053] (2)可以扩增α -珠蛋白基因簇中HBA2:c. 301-24delinsCTCGGCCC等位基因（所 述 HBA2:c. 301_24delinsCTCGGCCC 等位基因的序列具体为：gggttgcgggaggtgtagcgcaggcg gcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgacc ctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcac cgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccc tcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctga