步骤103、，以所述小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种DNA为模板，分别 使用201对SSR引物对其进行PCR扩增；
[0068] 201对SSR引物通过参考已经对小麦赤霉病抗性进行SSR分子标记的相关报道及 应用引物设计软件PrimerPremier5. 0结合GenBank数据库信息设计。
[0069] PCR 反应体系为 25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul，2. 5mMdNTPsO. 2ul， 正向引物和反向引物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，补水至25ul ;
[0070] PCR扩增参数为94°C预变性5min后，94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，循环34次，最后72°C延伸8min，4°C下保存；在Biometra公司的Tl型PCR扩增仪上 进行PCR扩增。
[0071 ] 步骤104、PCR扩增产物进行电泳分析
[0072] PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后，凝胶用 0. 2%硝酸银溶液浸泡震荡IOmin后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相，筛选出 具有多态性的28对SSR引物。如图1、图2所示，图1为引物P138PCR扩增后的电泳图，标 号为1、2、3分别代表高抗品种B1、B3、B5为模板的PCR扩增结果，标号为4、5、6分别代表高 感品种C1、C5、C6为模板的PCR扩增结果，从图中可以看到，以高抗品种B1、B3、B5为模板， 有扩增出产物，而以高感品种CU C5、C6为模板，没有扩增出与高抗品种扩增产物相同分子 量的产物，说明引物P138具有多态性，28对引物中其他27对引物结果与图1相同。图2是 引物P187PCR扩增后的电泳图，标号为1、2、3分别代表高抗品种B1、B3、B5为模板的PCR扩 增结果，标号为4、5、6分别代表高感品种CU C5、C6为模板的PCR扩增结果，从图中可以看 到，不论以高抗品种BI、B3、B5为模板，还是以高感品种Cl、C5、C6为模板，均有扩增出相同 分子量的产物，说明引物P187不具有多态性。
[0073] 筛选出的具有多态性的28对SSR引物如表二所示：
[0074] 表2有多态性的28对SSR引物序列表 CN 105176985 A I兄明书 6/9 页
CN 105176985 A 说明书 7/9 页
CN 105176985 A 说明书 8/9 页
[0078] 步骤105、以筛选出的28对SSR引物，以普通小麦和小麦赤霉病高抗品种RIL株系 DNA为模板进行PCR扩增；
[0079] 黑麦/豫麦2号杂交构建RIL株系，有多态性的28对SSR引物对133个RIL株系 DNA进行复筛。
[0080] PCR 反应体系为 25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul，2. 5mMdNTPsO. 2ul， 正向引物和反向引物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，补水至25ul ;
[0081] PCR扩增参数为94°C预变性5min后，94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，循环34次，最后72°C延伸8min，4°C下保存；在Biometra公司的Tl型PCR扩增仪上 进行PCR扩增。
[0082] 步骤106、PCR扩增产物进行电泳分析；
[0083] PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后凝胶用 0. 2%硝酸银溶液浸泡震荡IOmin后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相。根据电 泳结果，参照小麦赤霉病高抗品种和普通小麦的扩增结果，筛选出RIL株系的扩增结果呈 现多态性的SSR分子标记引物，共有7对引物，分别是Xssrpl9、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、 Xssrpl38、Xssrpl57及Xssrp201，如图3和图4所示，图中1为高抗（母本），2为高感（父 本），3~13为随机RIL系，筛选的7对SSR引物如表三所示：
[0084] 表3用于分子链锁作图的7对SSR引物序列表
CN 105176985 A 说明书 9/9 页
[0087] 步骤107、应用Joinmap4. 0软件构建遗传图谱。
[0088] 上述7个引物，其中有4个分别初步整合到已发表的3BS上的分子遗传图谱，3个 初步整合到7A上，如图5和图6所示。
[0089] 利用 Zhouetal 和 Shenetal 发表的定位于 3BS 上的 SSR 标记 Xgwm389、Xgwm493、 Xgwm533、XBarcl47、XBarcl31、XBarc238、XBarc217. 3、XCS-SSR7、XCS-SSR20 在群体中进 行基因分型，建立3BS赤霉病抗性QTL区域以SSR标记为基础的初级连锁图。本发明在 3BS上增加了 4个SSR标记，分别命名为Xssrp91、Xssrp97、Xssrp201和Xssrpl57。如图 5 所示，Xssrp201 位于 Xbrcl31 外侧 2. 6cM 处，Xssrp91 位于 Xbrcl31 外侧 2. 6cM 处 5. 7cM 处，Xssrp97 位于 Xssrp91 和 XCS-SSR7 之间距离 XCS-SSR73. OcM，Xssrpl57 在 Xgwm493 和 Xbarcl47之间靠近Xgwm4930. 7cM的位置。
[0090] Nicholson(2000)利用抗赤霉病品种Tritieummaeha为染色体供体的单体系列， 定位了 B1、4A和7A染色体与抗赤基因有关。本发明在7A染色体上增加了 3个SSR标记分 别命名为 Xssrpl9、Xssrp81、Xssrpl38。如图 6 所不，Xssrp81 在 Xwmcl68_7A 外侧 0· 2cM 处，Xssrpl38 在 Xwmc479 内侧 0· 2cM 处，Xssrpl9 在 Xssrpl38 和 Xwmc479_7A 之间距离 Xwmc479_7A0. 6Cm〇
[0091] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种远缘杂交小麦的SSR分子标记引物，其特征在于，所述引物包括XSSrpl9、 Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、Xssrpl57 及Xssrp201，各引物所对应的序列为： Xssrpl9 :正向ACATCATCAACTATGCCGAACA 反向 CGCCTTTAGATCCCACCC Xssrp81 :正向CGAGGGTCAAACGCAAAG 反向 ATCTCCGACGACGAGGGTG Xssrp91 :正向 CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC 反向 GCCGTGGACTTCCAITTCT Xssrp97 :正向CTGAAAGGAGCAACATAT 反向 TAAACAACCAAGGAAGAA Xssrp138 :正向GGAGCGGAATGGATAAATAA 反向 GGAAGGAAACGCAGGAGA Xssrpl57 :正向 GTCGTGCTTGCGTTAGAT 反向 GACTTGGAATGGAGGITG Xssrp201 :正向 TTGCCACGAAGTGATTGC 反向 ITGGATGATGCCCTGACC。2. 根据权利要求1所述的SSR分子标记引物，其特征在于，所述引物的退火温度分别 为： Xssrpl9 ：55〇C Xssrp81 ：60°C Xssrp91 ：50°C Xssrp97 ：55〇C Xssrpl38 ：50°C Xssrpl57 ：55〇C Xssrp201 :55°C。3. 根据权利要求I或2所述的SSR分子标记引物，其特征在于，小麦的远缘品种是小黑 麦。4. 根据权利要求3所述的SSR分子标记引物，其特征在于，Xssrp19、Xssrp81、Xssrp138 位于染色体7A上，Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl57和Xssrpl38位于染色体3BS上。5. 权利要求1所述的SSR分子标记引物的筛选方法，其特征在于，包括： A、 从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和赤霉病高抗品种； B、 通过小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种对201对SSR分子标记引物进行多 态性初步筛选； C、 通过小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通小麦的RIL株系对初 步筛选出的SSR分子标记引物进行多态性复筛，对复筛出的SSR分子标记引物进行分子连 锁图谱构建。6. 权利要求5所述的SSR分子标记引物的筛选方法，其特征在于，所述步骤A包括： (1)小麦开花时，采用单花滴注法进行赤霉病接种鉴定，接种后21d，调查接种穗的病小穗 数；用EXCEL计算每个品种的病情指数；参照江苏省农科院制定的单花滴注接种等级划分 标准进行等级划分；（2)同时对小麦进行室内毒素鉴定，使用赤霉菌粗毒素处理小麦幼苗 并计算根长抑制率、芽长抑制率和细胞损伤度，检测不同品种小麦对于赤霉菌粗毒素的抗 性；（3)根据间单花滴注赤霉病抗性鉴定和室内毒素鉴定结果进行系统比较和相关性统计 分析，确定赤霉病高抗品种和赤霉病高感品种； 所述步骤B包括：提取赤霉病高抗品种和赤霉病高感品种各品种小麦的DNA;分别用 201对SSR分子标记引物对上述各品种小麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，初步 筛选出具有多态性的SSR分子标记引物； 所述步骤C包括：提取小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通小麦 的RIL株系各品种小麦的DNA;分别用步骤B筛查出的SSR分子标记引物对上述各品种小 麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，复筛出具有多态性的SSR分子标记引物，应用 Joinmap4. 0软件构建其分子连锁图谱。7. 权利要求6所述的SSR分子标记引物的筛选方法，其特征在于，所述PCR反应体系 为：25ul，其中IOXbuffer2.5ul，25mMMg2+1.5ul，2.5mMdNTPs0.2ul，正向引物和反向引 物各Iul，Taq酶（5U/ul) 0. 2ul，模板DNA2. 5ul，补水至25ul;所述PCR扩增反应参数为 94°C预变性5min后，94°C变性lmin，50~60 °C退火lmin，72 °C延伸Imin，循环34次，最后 72°C延伸8min，在4°C下保存；PCR扩增产物在8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离， 电泳完成后，凝胶用0. 2%硝酸银溶液浸泡震荡IOmin后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透 射仪上照相。8. 权利要求7所述的SSR分子标记引物的筛选方法，其特征在于，所述的小麦远缘物种 包括小黑麦、小偃麦和小赖麦。9. 根据权利要求8所述的SSR分子标记引物的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增使 用仪器为在Biometra公司的Tl型PCR扩增仪。10. 权利要求1所述的SSR分子标记引物可用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性的相关 基因。
【专利摘要】本发明提供远缘杂交小麦的SSR分子标记引物及用途和筛选方法。所述引物包括Xssrp19、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157及Xssrp201，本发明提供的远缘杂交小麦的SSR分子标记引物，针对远缘杂交得到的小麦品种寻找赤霉病抗原。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105176985
【申请号】
【发明人】黄进勇, 肖国静, 陈晓兵, 刘彬, 张建波
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月28日