于固体培养基中培养7天后，刮取培养基中的白腐菌孢子分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液；氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙浓度为0.02g/mL，羧甲基纤维素钠浓度为0.03 g/mL ;制得的白腐菌悬液中，孢子浓度为1623个/mL。
[0037]3)共固定化微胶囊的制备:取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于浓度为0.02g/mL的海藻酸钠溶液中，得溶液A，溶液A中胞外酶交联聚集体分散浓度为湿重3g/L，木质素降解酶总酶活为102U/L ;然后再取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于步骤2)中的白腐菌悬液中，得溶液B，溶液B中胞外酶交联聚集体分散浓度为湿重2g/L，木质素降解酶总酶活大于102U/L ;将溶液B用医用注射器滴加到磁力搅拌器搅拌下的溶液A中，搅拌成囊，搅拌成囊时间为3min，再加无菌水稀释，过滤，得到微胶囊，然后将微胶囊置于50mL浓度为0.02g/mL的氯化I丐水溶液中固定60min，过滤，用无菌水洗涤3次，得到海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊。
[0038]实施例1制得的海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊中，粒度大小为:5 mm ;海藻酸I丐凝胶壳体厚度为:0.3 mm ;白腐菌胞外酶交联聚集体在海藻酸钙凝胶内浓度为:3g/L，湿重；胞外酶交联聚集体中木质素降解酶总酶活为150U/Lo壳体内部芯材氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中分散有白腐菌菌丝或孢子；白腐菌孢子浓度1623个/mL。氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙浓度为0.02g/mL，羧甲基纤维素钠的浓度为0.03 g/mLo。
[0039]4)降解能力对比:配制含40mg/L酸性大红GR的液体培养基，按照接种量为ImL培养基接I个生物微胶囊的比例进行接种，39°C，100rpm，培养三天测定碱性品红的降解率，并于同样接种量的传统固定化Phanerochae te疑胶颗粒相同条件下的降解率进行对比。
[0040]结果表明，3天后本发明生物微胶囊和传统固定化凝胶颗粒的脱色率分别为53%和30%，这表明共固定微胶囊有较高的脱色效率。
[0041]实施例2
选取为Trametes versicolor (购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号为CICC 50001)白腐菌菌种。
[0042]I)白腐菌胞外酶交联聚集体的制备:将白腐菌Trametes接种于液体培养基中，30°C恒温培养10天，过滤收集菌丝，菌丝备用，滤液进行透析，浓缩，制得粗酶液；向粗酶液中加入饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)，粗酶液、饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液体积比为1:9，磁力搅拌器搅拌下聚集15min，得反应液；向反应液中滴加25%戊二醛，使戊二醛最终体积浓度为0.3%，恒温震荡交联3h，交联温度为30°C，交联震荡频率为lOOrpm，离心速度为10000r/min，离心时间lOmin，用醋酸缓冲液(20mM，pH4.5)洗涤，得白腐菌胞外酶交联聚集体；
2)白腐菌悬液的制备:将步骤I)所收集的菌丝，打散分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液；氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙浓度为0.02 g/mL，羧甲基纤维素钠浓度为0.06 g/mL ;制得的白腐菌悬液中，菌丝浓度为200g/L。
[0043]3)共固定化微胶囊的制备:取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于浓度为0.015 g/mL的海藻酸钠溶液中，得溶液A，溶液A中胞外酶交联聚集体分散浓度为湿重2g/L，木质素降解酶总酶活为150U/L ;;然后再取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于步骤2)中的白腐菌悬液中，得溶液B，溶液B中胞外酶交联聚集体分散浓度为湿重2g/L，木质素降解酶总酶活大于150U/L ;将溶液B用医用注射器滴加到磁力搅拌器搅拌下的溶液A中，搅拌成囊，搅拌成囊时间为5min，再加无菌水稀释，过滤，得到微胶囊，然后将微胶囊置于10mL浓度为0.03 g/mL的氯化I丐水溶液中固定60min，过滤，用无菌水洗涤3次，得到海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊。
[0044]实施例2制得的海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊中，粒度大小为:7 mm ;海藻酸钙凝胶壳体厚度为:0.25 mm ;白腐菌胞外酶交联聚集体在海藻酸钙凝胶内浓度为2g/L外酶交联聚集体中木质素降解酶总酶活为150U/L。壳体内部芯材氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中分散有白腐菌菌丝或孢子；白腐菌菌丝浓度200g/Lo氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙浓度为0.02 g/mL，羧甲基纤维素钠的浓度为 0.06 g/mL。。
[0045]4)降解能力对比:配制含40mg/L酸性大红GR的液体培养基，按照接种量为ImL培养基接I个生物微胶囊的比例进行接种，39°C，lOOrpm，培养三天测定碱性品红的降解率，并于同样接种量的传统固定化Tnmetes KersicoJor凝胶颗粒相同条件下的降解率进行对比。
[0046]结果表明，3天后共固定化微胶囊和传统固定化凝胶颗粒的脱色率分别为70%和20%，这表明共固定微胶囊有较高的脱色效率。
【主权项】
1.一种海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊，其特征在于所述生物微胶囊包含有壳体以及壳体内部芯材；壳体材料为海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶内部包埋白腐菌胞外酶交联聚集体；壳体内部芯材为氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液，氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液内部分散有白腐菌细胞和白腐菌胞外酶交联聚集体。2.根据权利要求1所述的生物微胶囊，其特征在于:所述的生物微胶囊中白腐菌胞外酶交联聚集体的木质素降解酶总酶活大于60U/L。3.根据权利要求1所述的生物微胶囊，其特征在于:所述的白腐菌细胞为白腐菌菌丝或孢子；白腐菌细胞为菌丝时，浓度10-300g/L，湿重，白腐菌细胞为孢子时，浓度500-10000个/mL ;所述的氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙和羧甲基纤维素钠浓度均大于0.005 g/mL。4.根据权利要求1所述的生物微胶囊，其特征在于:所述的生物微胶囊粒度大小为:3-15mm ;壳体厚度为:0.2_2mm。5.一种权利要求1所述海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: O白腐菌胞外酶交联聚集体的制备:将白腐菌接种于液体培养基中，恒温培养6-10天，过滤，收集菌丝，备用；过滤后的滤液经透析，浓缩，制得粗酶液；向粗酶液中加入饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液，搅拌15-20min，得反应液；向反应液中滴加浓度为25%的戊二醛，交联，离心，用醋酸缓冲液洗涤，得到白腐菌胞外酶交联聚集体； 2)白腐菌悬液的制备，从下述a或b中选用任一方法制备白腐菌悬液: a将步骤I)所收集的菌丝，接种于固体培养基中培养5-8天后，刮取培养基中的白腐菌孢子分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液； b将步骤I)中收集到的菌丝打散，直接分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液； 3)共固定化微胶囊的制备:取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于海藻酸钠水溶液中，得溶液A ;然后再取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于步骤2)中的白腐菌悬液中，得溶液B ;搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，搅拌成囊，再加无菌水稀释，过滤，得到微胶囊，然后将微胶囊置于氯化钙水溶液中固定，过滤，用无菌水洗涤3-4次，得到海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述的，步骤I)中，液体培养基的组成为:2 g/L KH2PO4^0.25 g/L MgS04、0.1 g/L CaCl2、5 mg/L MnS04、5 mg/L VBU0.2 g/L酒石酸铵、20 g/L葡萄糖和150 mL/L的微量元素储备液； 所述的微量元素储备液的组成为=NaCl 1.0g/L、MgSO4-7H20 3.0g/L、FeSO4-7H20100mg/L、CoSO4WH2O 100mg/L、CaCl2 100mg/L、ZnSO4*7H20 100mg/L、CuSO4*5H20 10mg/L、KAl (SO4) 2 100mg/L、H3BO3 lOmg/L 和 NaMoO4 10mg/L。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述的，步骤I)中，粗酶液、饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液的体积比为1:5-9:0-1 ;所述的磷酸缓冲液pH为7.4，浓度为0.2-0.5M ;所述的，25%戊二醛在反应液中的体积浓度为0.2-0.4% ；所述的醋酸缓冲液pH为4.5，浓度为20mM ;所述的，粗酶液包含木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶中的一种或多种。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述的，步骤I)中交联为恒温震荡交联，交联温度为30°C，交联时间为1.5-9h，交联的震荡频率为60-100rpm，离心速度为10000r/min，离心时间为 20min。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:步骤2)中， 所述的，制得的白腐菌悬液中，含有湿重浓度为10-300g/L的菌丝或浓度为500-10000个/mL的孢子； 所述的，氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙和羧甲基纤维素钠浓度均大于0.01 g/mL ； 所述的，固体培养基的组成为:200g/L 土豆浸出液，20g/L葡糖糖，3g/L磷酸二氢钾，1.5g/L硫酸镁和20g/L琼脂。10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:步骤3)中，所述的，胞外酶交联聚集体中木质素降解酶总酶活大于60U/L ;海藻酸钠水溶液中海藻酸钠的浓度为0.005-0.04g/mL ;搅拌成囊时间为l_5min ;氯化I丐水溶液中固定时间为30_60min，固定所用氯化I丐水溶液中CaCl2浓度为0.02-0.03 g/mL,氯化钙水溶液的体积为所得共固定微胶囊体积的I倍以上；滴加操作可用医用注射器、蠕动栗；搅拌操作可用磁力搅拌器。
【专利摘要】本发明涉及海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊和其制备方法，所述生物微胶囊包含有壳体以及壳体内部芯材；壳体材料为海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶内部包埋白腐菌胞外酶交联聚集体；壳体内部芯材为氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液，氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液内部分散有白腐菌细胞和胞外交联酶聚集体。本发明生物微胶囊在制备过程中直接将白腐菌胞外酶制成交联酶聚集体，省去了将木质素降解酶系提纯的步骤，可有效降低生产成本，并与白腐菌形成密切的依附关系，提高了降解效率。
【IPC分类】C02F3/34, C12R1/645, C12N11/10, C12N11/14
【公开号】CN105176963
【申请号】
【发明人】李彦春, 王智, 郑力文, 祝德义, 徐旭东, 刘洁
【申请人】齐鲁工业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月16日