来源于树莓的聚酮合酶RinPKS1及其相关生物材料与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域中来源于树莓的聚酮合酶RinPKSl及其相关生物材料 与应用。
【背景技术】
[0002] 树莓（Rubus idaeus L )具有抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等多种药理和保健功能，已 在医药界和保健产品中广泛使用，其果实经炮制制成传统中药覆盆子，气味甘、平、无毒，有 益肾固精缩尿壮阳作用。
[0003] 覆盆子酮，又名悬钩子酮（Raspberry ketone)，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮， (4-(4-hydroxyphenyl)-2_butanone)，分子式为C1QH120 2。覆盆子酮在常温下为白色针状结 晶，其分子量为164. 20,熔点82-84°C，是一种经过美国食用香料制造者协会（FEMA)和欧洲 理事会（COE)共同认可使用的一种具有幽雅果香香韵的安全食用香料，FEMA编号为2588， 属于国家海关承认、产业政策鼓励发展的高新技术产品，属于具有果香味的暖香型香料，被 广泛用于食品、化妆品及医药中间体的合成。覆盆子酮作为树莓果实特征性香味物质，但在 树莓植物中含量很低，而且天然树莓资源非常有限，从树莓植物中提取天然覆盆子酮是不 经济的。覆盆子酮的生物合成途径见图1。由苯亚甲基丙酮合酶（Benzalacetone synthase， BAS)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A分子反应生成苯亚甲基丙酮（p-hydroxyphenyl but-3-ene-2-〇ne)，然后苯亚甲基丙酮在还原酶的催化下生成覆盆子酮。可见，苯亚甲基丙 酮合酶是覆盆子酮生物合成途径的关键酶和限速酶，也是利用基因工程技术分子调控覆盆 子酮生物合成的靶点。
[0004] 聚酮合酶（polyketide synthase，PKS)能催化生成一系列结构各异、具有不同生 理活性、具有查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS)基本骨架的植物次生代谢产物，对聚 酮合酶的基因进行调控可用于合成一些难以化学合成的新型天然化合物。近几年来，一系 列功能不同的聚酮合酶（polyketide synthase，PKS)不断被克隆，如查尔酮合酶、苗合酶 (Stilbene synthase，STS)、苯亚甲基丙酮合酶（benzalacetonesynthase，BAS)等。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何提高覆盆子酮的产量。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有聚酮合酶活性的蛋白质，名称 为RinPKSl，来源于树莓（Rubus idaeus L.)，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
[0007] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
[0008] b)在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0009] c)将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有聚酮合酶的蛋白质。
[0010] 其中，序列表中序列2由391个氨基酸残基组成。
[0011] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的氨基末端或羧 基末端连接上如表1所示的标签。上述b)可为在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的N端或/ 和C端连接上如表1所示的标签。
[0012] 表1.标签的序列
[0014] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为 不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0016] 上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 1所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0017] 与RinPKSl相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
[0018] 本发明所提供的与RinPKSl相关生物材料，为下述BI)至B20)中的任一种：
[0019] BI)编码RinPKSl的核酸分子；
[0020] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0021] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体；
[0022] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0023] B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物；
[0024] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0025] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0026] B8)含有M)所述重组载体的重组微生物；
[0027] B9)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0028] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0029] BI 1)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0030] B12)含有M)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0031] B13)含有BI)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0032] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0033] B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0034] B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0035] B17)含有BI)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0036] B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0037] B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0038] B20)含有M)所述重组载体的转基因植物器官。
[0039] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。BI)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)所示的 基因：
[0040] 1)其核苷酸序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0041] 2)与1)限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0042] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0043] 其中，SEQ ID No. 1由1176个核苷酸组成，编码SEQ ID No. 2所示的蛋白质。
[0044] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码RinPKSl的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 分离得到的RinPKSl的核苷酸序列80%或者更高同一性的核苷酸，只要编码RinPKSl且具 有聚酮合酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0045] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码SEQ ID No. 2所不的氣基酸序列组成的蛋白质的核昔酸序列具有80%或更尚， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0046] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次15min;或，0·lXSSPE(或0·lXSSC)、0·l%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0047] 上述80%或80%以上同一性，可为85%、90%或95%以上的同一性。
[0048] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码RinPKSl的核酸分子的表达盒（RinPKSl基 因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达RinPKSl的DNA，该DNA不但可包括启动RinPKSl 基因转录的启动子，还可包括终止RinPKSl转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括 增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异 的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动 子355:来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1&〇等人（1999)?1 &拉 Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2) 或LAP启动子（均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环 素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子 pF128 (CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特异的启动子（例 如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人（1985) EMBO J.4 :3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的 所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (N0S终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂 氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Ro