一种通过基因工程构建的短小芽胞杆菌CotA漆酶的利记博彩app_2

文档序号:8959421阅读:来源:国知局
收目的片段。回收的目的片段经突变片段组装后转化到DMT感受态细胞,转化 产物涂布于含l〇〇mg/L氨苄青霉素的LB平板,经37°C过夜培养,从平板上挑10个单菌落进 行菌落PCR验证,从验证成功的菌落中挑3个单菌落接入LB液体培养基,IOh后将每个菌液 保存到两个甘油管中,一份_20°C保藏,一份用于测序。将测序正确的突变体从甘油管接种 到LB液体培养基中过夜培养,过夜后先保存甘油管,然后将剩余菌液抽提质粒并转化接入 BL21(DE3)感受态细胞。
[0024] (2)突变体酶的表达与纯化
[0025] 突变体表达及纯化过程如实施例1所述。
[0026] 实施例3 CotA漆酶突变体酶活分析。
[0027] (1)酶活单位定义
[0028] 采用ABTS方法测定漆酶酶活时,定义每分钟转化1 μ mol底物时所需要的酶量作 为一个活力单位。
[0029] (2)酶活力测定步骤
[0030] 预热:取2. 4mL pH4. 0的柠檬酸缓冲液于试管中,在试管中加入0. 5mL ABTS溶液 (ABTS的终浓度为0. 5mM)置于37°C水浴锅中预热2min。
[0031] 反应:加入0.1 mL样品酶液,震荡均匀。
[0032] 测量:将震荡均匀的样品用分光光度计进行动力学测量,在420nm波长下测量30s 内每秒钟OD值的变化量(反应速率为匀速反应)并计算酶活力。
[0033] 实施例4漆酶动力学参数测定
[0034] 以不同浓度的ABTS作为底物来测定纯酶的动力学参数。在3mL的反应体系中 ABTS的终浓度范围是5-500 μΜ。3mL的反应体系包括2mL柠檬酸缓冲液(0.1 M ;pH4. 0)、 0.1 mL纯酶液、0. 9mL的ABTS溶液(根据终浓度取相应体积的ABTS母液后用去离子水稀释 至0. 9mL)。将反应体系置于37°C水浴锅中反应片刻,在420nm波长下测定30s内每秒钟OD 值的变化量(反应速率为匀速反应)。根据酶活力公式计算酶活。以
作图,得出一 直线。直线的斜率为
与纵轴的交点
与横轴的交点。这样可以 求出动力学参数Vniax和Kni,测出蛋白含量后就能求出kMt。
[0035] 酶活力公式:酶活力
[0036] 式中:A OD-吸光度OD的变化值V,& -反应体系的体积
[0037] η-酶液稀释倍数 At-反应时间
[0038] V。-酶液的体积 ε-底物的摩尔吸光系数
[0039] 实施例5漆酶突变体的底物专一性
[0040] 以ABTS为底物测定了野生型和突变体漆酶的动力学参数V_、K"、keat、
[0041] 表1野生型(WT)和突变体漆酶的动力学参数
[0042] CN 105176940 A 说明书 4/4 页
[0043] Kn值可以判断酶的专一性和天然底物,最适底物时酶的亲和力最大K n最小。
[0044] 在一定酶浓度,酶对特定底物的Vniax也是一个常数。
[0045] krat表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数,这个常数通称 为催化常数,其值越大表示酶的催化效率越高。
[0046] 是酶和底物反应形成的表观二级速率常数,有时也称为专一性常数。
[0047] 从表1可以计算得出,突变体与野生型漆酶相比,L386W的专一性和催化效率有所 提高。突变体L386W的专一性是野生型的1. 5倍,催化效率是野生型的1. 2倍。
[0048] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技 术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种短小芽胞杆菌CotA漆酶的突变体,其特征在于,是以野生型短小芽胞杆菌CotA 漆酶基因为模板将其第386位的Leu突变为Trp。2. 权利要求1所述的突变体的制备方法,包括如下步骤: (1) 以前期构建的质粒PColdII-CotA为模板,采用滚环PCR的方法,设计引物时在重叠 区域引入突变位点,利用PCR扩增质粒pColdll-CotA得到含有编码CotA漆酶突变体的基 因序列的开环重组载体; (2) 在PCR产物中加DMT酶消化PCR产物,然后进行1 %琼脂糖凝胶电泳回收片段; (3) 利用特殊的重组酶和同源重组原理,将开环重组载体无缝拼接,形成环状结构; (4) 将环状质粒转化到DMT感受态细胞中,平板培养挑取单菌落测序,为的是提取到正 确突变质粒; (5) 将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),诱导表达。3. 根据权利2所述的方法,其特征在于,还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和 HisTrapHPImL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。4. 根据权利2所述的方法,其特征在于,将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的 LB培养基中37 °C液体培养过夜,后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37 °C培养至 OD6。。~0. 5,迅速降温至15°C静置至少30min,加入最终浓度0. 3mM的诱导剂IPTG诱导,24h 时离心获得沉淀,用缓冲液重悬,即为粗酶液。突变体L386W对底物2, 2-联氮-二(3-乙 基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的专一性,是野生型的1. 5倍,且催化效 率是野生型的1.2倍。
【专利摘要】本发明公开了一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体,属于基因工程和酶工程领域。本发明以本实验室前期构建的pColdII-CotA重组质粒为模板,将野生型CotA漆酶氨基酸序列中的第386位Leu突变为Trp,随后以野生型CotA漆酶为对照,发现突变体L386W对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的专一性,提升了短小芽胞杆菌CotA漆酶的工业应用前景。
【IPC分类】C12N9/02, C12N15/53, C12N15/70
【公开号】CN105176940
【申请号】
【发明人】管政兵, 陈宇, 廖祥儒, 蔡宇杰, 戴紫雯
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月29日
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