aRS。
[0042] 实施例3 CueO - M355 - HqAla突变体的表达和纯化
[0043] 将实施例1得到的M355突变体质粒pET28c - M355 (卡那霉素抗性）和实施例2 得到的8 -羟基喹啉丙氨酸辅助质粒pEVOL - tRNA - HqAlaRS (氯霉素抗性）共同转化大肠 杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，经卡那霉素和氯霉素双抗平板筛选，获得两种质粒共转的阳 性菌株。
[0044] 将筛选出的阳性菌株接种于LB培养基（含有卡那霉素和氯霉素）中，37°C过夜培 养后转入IL LB培养基（含有卡那霉素和氯霉素）中，37°C培养至OD6。。约为0.8,然后加入 HqAla至终浓度ImM，IPTG至终浓度0. 5mM，阿拉伯糖至终浓度0. 2%，20°C诱导12h。
[0045] 对诱导表达后菌液进行SDS -PAGE电泳鉴定，电泳结果如图2所示，表明获得了大 小约50kD的大肠杆菌漆酶，并且位置与大肠杆菌漆酶野生型一致。
[0046] 将收集的菌体用Lysis buffer重悬，超声破碎，破碎液离心上清与Ni-NTA beads 在4°C结合lh，经过不同浓度的咪唑洗脱液洗脱，获得较纯的CueO -M355 -HqAla，纯度约为 90%〇
[0047] 在以上实施例中将8 -羟基喹啉丙氨酸辅助质粒pEVOL - tRNA - HqAlaRS (氯霉素 抗性）替换为3 -吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL - tRNA - PyTyrRS (氯霉素抗性）即可制得 CueO - M355 - PyTyr0
[0048] 实施例4 CueO各突变体的酶活检测
[0049] 根据实施例3所述表达纯化方法，表达CueO的突变体。
[0050] 以 ABTS 作为底物，检测 CueO -WT、CueO -E106 -PyTyr、CueO -K147 -PyTyr、CueO - M355 - PyTyr 和 CueO - N408 - PyTyr 的酶活。
[0051] 酶活反应体系为 IOOmM NaAc ρΗ4· 8, ImM ABTS，0. 3uM CueO, IOmM CuC12,反应温度 25°C，420nm吸光度检测，根据酶活反应曲线来计算CueO突变体的酶活。
[0052] 酶活测定结果显示，CueO - E106 - PyTyr、CueO - K147 - PyTyr、CueO - M355 - PyTyr 和CueO - N408 - PyTyr与野生型CueO - WT相比，酶活均有了显著提升，其中CueO - K147 - PyTyr的酶活提高了约5倍，见图3所示。
[0053] 实施例5 CueO突变体促进降解苯并芘
[0054] 根据实施例3所述表达纯化方法，表达CueO的突变体。
[0055] 以苯并芘作为底物，检测 CueO - WT、CueO - K147 - PyTyr、CueO - K147 - HqAla、 CueO - M355 - PyTyr和CueO - M355 - HqAla对苯并芘的降解效率，实验方案如下：
[0056] 1、培养基：富集培养的无机盐培养基（MSM)组成：Na2HP04 2g，KH2P04 Ig MgS04 · 7H20 0· 5g, (NH4)2S04 0· lg,微量元素溶液 5mL, H201000mL，ρΗ7· 2 - 7· 5,及 0.01mg/L苯并芘；
[0057] 2、上述培养基中，接种对苯并芘有降解作用的分支杆菌，对比加入0. lmmol/L大 肠杆菌重组漆酶和未加入重组漆酶组对苯并芘的降解效果；
[0058] 3、溶液中苯并芘提取与分析：将菌液转移至125ml分液漏斗中，向分液漏斗中加 入菌液体积1/2的二氯甲烷，震荡后静置15min，将下层有机相转至干净三角瓶中。重复以 上步骤一次，向三角瓶中加入5g无水硫酸钠，静置30min后取液体用气相色谱一质谱联用 仪测定多环芳烃含量。
[0059] 4、苯并芘GC - MS检测条件：苯并芘含量检测采用GC - MS (ThermoFisher ITQ -1100)检测，具体测定条件如下：色谱柱：DB - 5ms 30mB - 5ms mm - 5ms um ;载气：高纯 He(99. 9999% ) 1.0 ml/min ;进样口温度：300°C，不分流进样；色谱升温程序：60°C- 25°C / min - 25CTC (Imin) - 5°C /min - 28CTC (4min) - 5°C /min - 29CTC (5min);传输线温 度：280°C ;离子源温度：250°C ;电子激发能量：70eV ;扫描模式：选择离子扫描SHL
[0060] 4、检测结果：
[0061] 与分支杆菌对苯并芘约60%的降解效率相比，四种插入非天然氨基酸的CueO突 变体降解效率均高于80%，其中CueO - K147 - HqAla的降解效率更是达到了 99%。
[0062] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，其特征在于，所述漆酶CueO的氨基酸序 列为SEQIDNO: 1 ;漆酶CueO突变体为漆酶CueO的第106位的谷氨酸、第132位的天冬氨 酸、第144位的谷氨酰胺、第147位的赖氨酸、第354位的丝氨酸、第355位的甲硫氨酸、第 408位的天冬酰胺和第412位的甘氨酸中的任意一个位点替换为非天然氨基酸形成。2. 如权利要求1所述的含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，其特征在于，所述非天然 氨基酸为3 -吡唑酪氨酸或8 -羟基喹啉丙氨酸。3. 如权利要求1所述的含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，其特征在于，所述漆酶 CueO突变体于大肠杆菌中表达。4. 一种表达漆酶CueO突变体的方法，包括如下步骤： 1) 根据漆酶CueO的氨基酸序列和蛋白空间结构，选择突变位点； 2) 使用定点突变PCR技术，将选定的突变位点的密码子突变为终止密码子； 3) 将突变的漆酶CueO基因序列构建到pET- 28c表达载体上； 4) 将漆酶CueO突变体表达载体与可特异性引入3 -吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL-tRNA-PyTyrRS或8 -羟基喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL-tRNA-HqAlaRS共同转化大肠杆 菌BL21 (DE3)，在培养基中添加IPTG、阿拉伯糖和非天然氨基酸进行漆酶CueO突变体的诱 导表达； 5) 将表达有目的蛋白的大肠杆菌收集后，超声破碎，并亲和纯化得到含非天然氨基酸 的漆酶CueO突变体。5. 如权利要求4所述的利用大肠杆菌表达漆酶CueO突变体的方法，其特征在于，所述 非天然氨基酸为3 -吡唑酪氨酸或8 -羟基喹啉丙氨酸。6. 如权利要求4所述的利用大肠杆菌表达漆酶CueO突变体的方法，其特征在于，所述 终止密码子为琥珀密码子TAG。7. 如权利要求6所述的利用大肠杆菌表达漆酶CueO突变体的方法，其特征在于，所述 突变的漆酶CueO基因序列由SEQIDNO: 2中第316~318位的GAA，第394~396位GAT， 第430~432位的CAG，第439~441位的AAA，第1060~1062位的TCT，第1063~1065 位的ATG，第1222~1224位的AAC，第1234~1236位的GGT中的任意一个替换为TAG形 成。8. -种权利要求1所述的含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体于降解苯并芘的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种含有非天然氨基酸的漆酶，及该漆酶的制备方法和漆酶的应用。制备方法具体为先使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点插入到大肠杆菌漆酶中，再利用大肠杆菌表达含非天然氨基酸的漆酶。该漆酶提高了对铜离子的亲和力，增加了漆酶内部Cu离子的占有率，并进而提高了漆酶酶活，改善了漆酶的外源铜离子依赖性。本发明还涉及含有非天然氨基酸的漆酶用于降解环境污染物苯并芘的应用。
【IPC分类】C12N9/02
【公开号】CN105176939
【申请号】
【发明人】周娟作, 郑朋, 王江云, 刘鹏程, 金京华, 赵旭
【申请人】北京安生绿源科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月2日