。接种15株。然后将植株放于20~25°C，光 照/黑暗各12h的温室中培养。给植株浇水时避免沾到伤口，其它管理同日常苗木管理。
[0048] 实施例3柑桔黄化脉明病毒的侵染性鉴定
[0049] 将实施例2中接种后在温室管理1个月后的植株按照周常勇等（一种微量、快速 抽提柑橘衰退病毒（CTV)核酸应用于RT-PCR扩增的方法，福建农业学报.2001，30 (增）： 200)的方法提取接种植株的新梢，以及正对照植株（用传统方法嫁接接种CYVCV的尤力克 柠檬）的总核酸，然后进行RT-PCR检测。具体操作步骤如下：
[0050] 1)称取5~IOmg植株的皮或叶装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入 60 μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合液，混匀。
[0051] 2) 70°C水浴5~lOmin。然后室温下13000rpm离心5min，吸取40 μ L上清液加入 由Sephadex G-50-80构成的微柱中4°C，5000rpm离心4min，用一新无菌离心管收集洗脱 液。-20 °C保存备用。
[0052] 3)用 PrimeScript?One St印 RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒对获得的总核 酸进行RT-PCR检测，所用引物为陈洪明等（尤力克柠檬上一种新病害的生物学 特性及RT-PCR检测，2015)发表的上游引物：5' -TACCGCAGCT ATCCATTTCC-3'和 下游引物：5' -GCAGAAATCCCGAACCACTA-3'。反应条件为 50 °C 30min ;94 °C 2min ; 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 30sec，循环 30 次；72°C 5min〇
[0053] 4) RT-PCR检测结果显示，所有接种植株和正对照均可检测出CYVCV (电泳条带如 图1所示，均检测得到一条614bp的条带）。PCR产物纯化后与pMD19-T载体于4°C连接过 夜，并转化感受态菌株JM-109。挑取单个的转化菌落，加 LB液体培养基培养24h后送阳性 克隆进行测序。结果与CYVCV毒株Yl (NCBI号：JX040635. 1)相应序列的相似性为100%， 进一步证实感染了 CYVCV。此外，接种后1个月的尤力克柠檬新梢表现出与正对照植株（用 传统方法嫁接接种CYVCV的尤力克柠檬）上相同的黄化、脉明症状。表明本发明的柑桔黄 化脉明病毒提取和接种方法完全可靠。
[0054] 实施例4柑桔黄化脉明病毒不同提取方法得到的病毒浸染性比较
[0055] 采用5种方法A、B、C、D、E，来进行柑桔黄化脉明病毒不同提取方法的浸染性比较 实验。5种方法具体如下：
[0056] 方法A :柑桔黄化脉明病毒提取按照Alshami等（A hitherto unreported yellow vein clearing disease of citrus in India and its viral aetiology，2003)的方法操 作，具体操作如下：50g表现症状的尤力克柠檬叶片加入少许金刚砂和适量pH7. 0的0. 05M K2HPO4溶液进行匀浆,K2HPO4溶液的最终使用量为50mL，得到的匀浆液即为柑桔黄化脉明病 毒提取液。接种方法为：用灭菌海绵蘸取少许金刚砂在无病毒植株的叶面轻刷1~2次后， 将上述匀浆液涂抹于表面。
[0057] 方法B :柑桔黄化脉明病毒的提取方法与方法A中的提取方法相同，接种方法为本 发明实施例2中的接种方法。
[0058] 方法 C :按照 Loconsole 等(Identification and characterization of Citrus yellow vein clearing virus, a putative new member of the genus Mandarivirus，2012)的抽提方法提取病毒颗粒，具体操作如下：将100g表现症状的尤力克 柠檬叶片在液氮中研磨后加入400mL ρΗ8· 3的0· IM柠檬酸钠（含20mM DIECA，2mM EDTA) 匀浆，经3层纱布过滤后滤液4°C 1000 Orpm离心10min。按体积比在上清中加入2%体积 的Triton X-100后4°C 36000rpm离心lh。用pH8. 3的RB缓冲液（含有0.0 lM柠檬酸钠， 0. 5M尿素，0. ΙΜβ-巯基乙醇）悬浮沉淀后4°C 12000rpm离心10min。获得的上清加入5mL 用0. 01M、pH8. 3的柠檬酸钠溶解的20%蔗糖溶液，然后4°C 27000rpm离心2. 5h，获得的沉 淀再次用RB缓冲液（0.01M柠檬酸钠，0.5M尿素，0. ΙΜβ-巯基乙醇）在4°C下悬浮48h后 4°(： 10000印111离心101^11。上清进行4°(：、35000邝111、25%~40%硫酸铯密度梯度离心3.511。 可以在离心管中观察到一条乳白色的带，该带即为CYVCV颗粒所在位置，用无菌ImL注射器 将该带洗出后置于冰上保存。接种时采用方法A中的接种方法。
[0059] 方法D:柑桔黄化脉明病毒的提取方法与方法C中的提取方法相同，接种方法为本 发明实施例2中的接种方法。
[0060] 方法E :柑桔黄化脉明病毒提取方法为本发明实施例1中的病毒提取方法，接种方 法为本发明实施例2中的病毒接种方法。
[0061] 以上五种方法，每种方法都接种无病毒的尤力克柠檬、代代酸橙、邓肯葡萄柚、墨 西哥来檬、温州蜜柑和凤梨甜橙各10株。接种后将植株放于20~25°C，光照/黑暗各12h 的温室中培养。浇水时避免沾到伤口。其它管理同日常苗木管理。
[0062] 接种1个月后，分别按照实施例3中的方法通过RT-PCR检测植株感染CYVCV的情 况，结果发现，采用方法A、B、C和D提取、接种的植株都未检测出CYVCV，而采用方法E提 取和接种的植株都感染了 CYVCV，并且尤力克柠檬和代代酸橙这两个敏感品种的新梢上都 出现了叶卷、黄脉等典型症状，较为耐病的温州蜜柑的新梢上也出现了脉明症状，如图2所 示。直到接种后4个月，采用方法A浸染的尤力克柠檬和代代酸橙各有1株检测出CYVCV， 其余植株中均未能检测出CYVCV ;采用方法B、C和D提取和接种的植株始终未能检测出 CYVCV，结果如表1所示。结果证明，本发明的柑桔黄化脉明病毒提取方法是一种简单、快 速、高效，能够获得高侵染性CYVCV颗粒的方法，说明本发明方法提取得到的CYVCV具有很 好的活性。
[0063] 表1柑桔黄化脉明病毒不同提取方法的病毒浸染性比较
【主权项】
1. 一种快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在于：包括如下步 骤： 1) 取柑桔黄化脉明病病株组织5~IOg在液氮中研磨，研磨后按照重量/体积比加入 2~4倍体积的提取缓冲液进行匀浆； 2) 将步骤1)得到的匀浆液在冰上静置3~7min，用纱布过滤，将滤液4°C3000~ 5000rpm离心15~25min后取上清，将上清液用Miracloth滤膜过滤，滤液倒入超速离心管 中，每管分装9mL滤液； 3) 在步骤2)中的离心管中从底部缓慢加入ImL蔗糖垫； 4) 将步骤3)中的离心管进行4°C36000~40000rpm超速离心2~3h，离心结束后用 无菌针头在离心管底部扎小洞，用无菌离心管承接最初流出的1~I. 3mL溶液，即为粗提 液； 5) 将步骤4)得到的2个离心管中的粗提液倒入1个新的超速离心管中，并加入提取缓 冲液将总体积配至9mL，颠倒混匀后从离心管底部缓慢加入ImL蔗糖垫，进行4°C36000~ 40000rpm超速离心2~3h; 6) 将步骤5)中的离心管用针头在离心管底部扎小洞，弃去最初流出的300yL溶液，并 用无菌离心管承接随后流出的400yL病毒提取液，即得到有活性的柑桔黄化脉明病毒，冰 上放置备用； 以上所述提取缓冲液为用PH7.4 40mM磷酸盐缓冲液配制的4~6% (w/v)的蔗糖溶 液，并且含有IOmMDTT;以上所述蔗糖垫为用pH7. 4 40mM磷酸盐缓冲液配制的65~75% (w/v)的蔗糖溶液，并且含有IOmMDTT;所述pH7. 440mM磷酸盐缓冲液用K2HP04、KH2P0# 无菌水制得。2. 如权利要求1所述的快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在 于：所述步骤1)中的柑桔黄化脉明病病株组织为叶片或树皮。3. 如权利要求1所述的快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在 于：所述步骤1)中提取缓冲液的加入量为按照组织/缓冲液的重量/体积比的3倍。4. 如权利要求1所述的快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在 于：所述提取缓冲液为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5% (w/v)的蔗糖溶液，并且 含有IOmMDTT;所述蔗糖垫为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的70% (w/v)的蔗糖 溶液，并且含有IOmMDTT;所述pH7. 4、40mM的磷酸盐缓冲液每升含32. 08mLIMK2HP04、 7. 92mLIMKH2P04,用无菌水定容至1L。5. 如权利要求1所述的快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在 于：所述步骤4)中用无菌离心管承接最初流出的粗提液，承接体积为I.OmL。6. 如权利要求1所述的快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，其特征在 于：所述步骤4)、5)中的超速离心转速为38000rpm，离心2h。
【专利摘要】本发明公开了一种快速、简捷提取有活性的柑桔黄化脉明病毒的方法，通过将病株组织于液氮中研磨后，加入提取缓冲液进行匀浆，纱布过滤后的滤液经4℃低速离心，上清用Miracloth滤膜过滤后进行超速离心，得到的粗提液混合后再次超速离心，即获得的具有极高侵染力的病毒颗粒。本方法在5h内即可完成病毒的提取，且能高效侵染多种柑桔品种，提取的病毒可应用于制备高度专一的抗血清，致病性鉴定、病毒特性分析，以及抗性品种测定。本发明方法简便、快捷、能高效保持柑桔黄化脉明病毒的活性。
【IPC分类】C12N7/00
【公开号】CN105176935
【申请号】
【发明人】周彦, 周常勇, 马丹丹
【申请人】西南大学柑桔研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月16日