施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0040] 本发明提供的培养基及其应用、制备方法中所用细胞、试剂、仪器等均可由市场购 得。
[0041] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0042] 实施例1~12培养基的制备
[0043] 培养基的制备方法如下：
[0044] (1)无菌条件下分离提取新西兰大白兔眼角膜上皮细胞，接种于25cm2细胞培养瓶 中，于37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养，48h细胞贴壁后首次换液，以后隔天换液，每天 倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。角膜上皮细胞培养基为lOOU/mL青霉素和lOOU/mL 链霉素，DMEM/F12培养基，10%胎牛血清。
[0045] (2)待⑴中细胞达80% -90%融合时，0· 25%胰蛋白酶-0· 02% EDTA消化液消 化收集细胞，调整细胞密度为IX IO9个/L，接种于新的25cm2的培养瓶中，置37°C、5% CO2、 饱和湿度培养箱中培养。角膜上皮细胞培养基同步骤（1)。
[0046] (3)分别收集（2)中细胞培养特定时间段（见表1)的培养液至离心管，2000rpm/ min离心10min，无菌条件下取上清液，经0. 22 μ m滤器过滤，过滤后的上清液经镜检不含角 膜上皮细胞。-20 °C冰箱保存备用。
[0047] (4)将（3)中收集的上清液与人间充质干细胞完全培养基按照不同比例混匀（见 表1)，制备混合培养基。其中，人间充质干细胞完全培养基成分包括：100U/mL青霉素和 lOOU/mL链霉素，体积分数为45%角朊细胞无血清培养基的培养液，15ng/mL表皮生长因子 (EGF)，15 μ g/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。
[0048] (5)无菌条件下摘取兔眼角膜基质约1cm2,将基质片剪成ImmX Imm的组织块。
[0049] (6)把上述组织块与（4)中的混合培养基按体积比1 :10混合，制备成本发明的培 养基。
[0050] 实施例1~12的培养基制备条件如下表所示：
[0051] 表1实施例1~12的培养基制备条件
[0054] 实施例13定向分化试验
[0055] 定向分化试验操作步骤如下：
[0056] (I) hUC-MSCs培养分为对照组和实验组。将消毒好的18mmX 18mm盖玻片放入六孔 板中，将制备好的密度为5 X IO4个/mL的hUC-MSCs悬液加入六孔板，每孔2mL，置37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，24h首次换液，以后每2d全量换液，倒置相差显微镜下每天观 察细胞生长情况。
[0057] 其中，实验组采用实施例1~12的培养基培养hUC-MSCs ;对照组采用人间充质干 细胞完全培养基培养hUC-MSCs作为对比例。
[0058] (2)细胞培养7d后，取出孔内盖玻片进行免疫荧光检测CK12的表达。具体步骤如 下：
[0059] 固定：吸去培养基，PBS轻轻漂洗3次，加4%多聚甲醛常温下固定15min。
[0060] 洗涤：吸去多聚甲醛，加 PBS后置于脱色摇床上轻轻漂洗，重复3次，5min/次。
[0061] 透膜：以含0. 3% TritonX-IOO的PBS室温下通透化处理30min。
[0062] 封闭：以5 %兔血清室温下封闭Ih。
[0063] -抗孵育：加羊抗人CK12 (1:150)，4°C孵育过夜。
[0064] 洗涤：加 PBS摇床上漂洗5次，每次5min。
[0065] 二抗孵育：加兔抗人IgG-FITC，室温下避光孵育30min。
[0066] 洗涤：加 PBS摇床上避光漂洗5次，每次5min。
[0067] 染核：滴加 DAPI工作液1滴于盖玻片上，室温下避光作用20min。
[0068] 防淬灭：滴加抗荧光淬灭剂于盖玻片上。
[0069] 封片：将盖玻片细胞面倒扣于载玻片上，周边涂指甲油封片。
[0070] 保存：4°C避光保存，3d内荧光显微镜下观察拍照。
[0071] 研究结果表明，对照组和各个实验组均有细胞胞浆见绿色荧光，即CK12表达阳 性。但对照组显绿色荧光的细胞数明显少于各实验组。
[0072] (3)对染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较，诱导分化率=染色阳 性细胞数/细胞总数X 100%。实验结果见表2、图1 :
[0073] 表2诱导分化率检测结果
[0075] 注：与对照组相比，林Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05。
[0076] 诱导分化率统计分析表明，本发明提供的培养基实验组的诱导分化率高于对照 组，各实验组与对照组均有显著性差异（Ρ〈〇. 05)。尤其是实施例7(含75%、培养48h 上清液的培养基实验组）的诱导分化率明显高于其它各组，与其它各组均有显著性差异 (p〈0.01)。可见，本发明提供的培养基可有效促进hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化。
[0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种培养基，其特征在于，包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述角膜基质与所述角膜上皮细胞培 养上清液的体积比为1 : (10~20)。3. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括人间充质干细胞完 全培养基。4. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述人间充质干细胞完全培养基的配 方为：80~1201]/11^青霉素，80~1201]/11^链霉素，45%~75%角朊细胞无血清培养基的 培养液，5~25ng/mL表皮生长因子，5~25yg/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。5. 根据权利要求3或4所述的培养基，其特征在于，所述人间充质干细胞完全培养基与 所述角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，所述角膜上皮细胞培养上清液在所述 混合培养基中的体积百分含量至少为25%。6. 如权利要求1至5中任一项所述培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞 中的应用。7. 如权利要求1至5中任一项所述培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :待角膜上皮细胞达80 %~90 %融合，酶解，获得细胞悬液； 步骤2 :取所述细胞悬液接种，培养，收集角膜上皮细胞培养上清液； 步骤3 :取角膜基质与所述角膜上皮细胞培养上清液混合，获得培养基。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3为将人间充质干细胞完全 培养基与所述角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合培养基，取角膜基质与所述混合培养 基混合，获得培养基。9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中培养的时间为24~ 72h〇10. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中培养采用的培养基为 角膜上皮细胞培养基，其配方为：80~120U/mL青霉素，80~120U/mL链霉素，5%~20% 胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。
【专利摘要】本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、制备方法。该培养基包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。本发明提供的培养基明显提高了hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105176912
【申请号】
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 戚康艺
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月28日