甘蓝夜蛾核型多角体病毒敏感，可以观察到典型的细胞核增大，内含有大量的多角体病毒(图5)。
【附图说明】
[0019]图1培养30天后细胞系的培养形态。
[0020]图2细胞系的生长曲线。
[0021]图3细胞系的核型。
[0022]图4细胞系的DAF-PCR鉴定图谱。
[0023]图5细胞系感染核型多角体病毒后获得大量的病毒多角体。
【具体实施方式】
[0024]实施例1.二化螟幼虫中肠细胞系的建立
(1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；
(2)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒10分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；
(3)将虫体置于用75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，取出二化螟幼虫中肠；
(4)用生理盐水清洗(3)所取组织3次，再用HBSS清洗液清洗组织2次，最后再用细胞培养液TNM-FH清洗中肠I次，HBSS清洗液含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的链霉素，0.5 μ g /ml的两性霉素B ；
(5)将清洗过的中肠组织剪碎，置于预先盛有Iml细胞原代培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养；
(6)过夜后，待组织贴壁后，再加入2ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在与步骤(5)同样条件下培养，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；
(7)每隔5-7天吸出50%量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液；
在上述操作后5天后可观察到大量增殖的单个细胞并逐渐向外围扩展；第40天后，增殖细胞铺满细胞培养瓶表面；把含有新增值的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，按照1:5 (细胞体积:最后培养液体积)进行传代培养。二化螟幼虫脂肪体细胞系初步建立成功；过程都是在无菌条件下进行的。
[0025]
实施例2细胞系的生物学特性观察和测定
(O形态特征:经显微镜观察，该细胞系贴壁生长，主要有三种细胞形状:大部分圆形，少部分梭形，较少似巨噬细胞形(图1)。圆形细胞占90%，平均直径12.49±1.15μπι;梭形细胞长约21.0—40 μ m,宽平均约11 μ m ;巨噬细胞直径20-22 μ m之间；
(2)细胞的生长:生长曲线呈典型的“S”，群体倍增时间为78小时(图2)；
(3)核型分析:二化螟的染色体数目n=29，而本发明所建立的细胞系的染色体数目在136-147，因此，新建立的细胞系由5倍体细胞组成(图3)；
(4)DAF-PCR鉴定:用白细胞介素-1β设计引物，利用DAF-PCR的方法鉴定了本发明建立的细胞系的确来源于二化螟幼虫的中肠细胞，而非其他细胞系的污染(图4)。由细胞系提供的DNA条带与二化螟幼虫DNA扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同。
[0026]实施例3病毒敏感性和产量的测定
细胞系对甘蓝夜蛾核型多角体病毒敏感性测定:取对数生长期细胞，调配成IxlOfVmL浓度，接种到培养瓶中，每瓶10mL。培养3小时后，弃去培养基，留下贴壁细胞，将制备好的病毒液接种于该细胞，每瓶lOOuL。培养7天后，收获细胞及病毒多角体，用血球计数板在显微镜下计数病毒多角体数目，结果本发明所建细胞系所产多角体浓度达16.5xl06/PIB/mL。同时，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含有大量的多角体颗粒(图5)。
【主权项】
1.一种高产杆状病毒的二化螟幼虫中肠细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；(2)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10?20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2?3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体； (3)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，取出二化螟幼虫中肠； (4)用生理盐水清洗(3)所取组织3-5次，再用HBSS清洗液清洗组织2_3次，最后再用细胞培养液TNM-FH清洗中肠I次，HBSS清洗液含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的链霉素，0.5 μ g /ml的两性霉素B ； (5)将清洗过的中肠组织剪碎，置于预先盛有Iml细胞原代培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养； (6)过夜后，待组织贴壁后，再加入2ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在与步骤(5)同样条件下培养，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中； (7)每隔5-7天吸出50%?70%量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶； (8)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞传代培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞传代培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功； 整个过程都是在无菌条件下进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.0-6.8。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，pH值为6.0-6.8。4.根据权利要求2和3任一项所述的方法，其特征在于，所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH,所述的动物血清为胎牛血清。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的动物血清体积比含量为10%?20%。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的动物血清体积比含量为10%-20%。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。9.一种权利要求1所述高产杆状病毒的二化螟幼虫中肠细胞系在杆状病毒的大规模生产上的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其中的杆状病毒是甘蓝夜蛾核型多角体病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种来源于昆虫中肠组织，并且对杆状病毒高敏感的细胞系，本发明还公开了该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生长上的用途。该细胞系可以用来复制这类病毒，用于杆状病毒杀虫剂的规模化生产，以及构建杆状病毒表达载体系统，表达具有商业或科学价值的蛋白质。因而具有极高的商业和科研价值。
【IPC分类】C12N5/07, C12N7/00, C12R1/91
【公开号】CN105176911
【申请号】
【发明人】刘光富, 许益鹏, 杨倩倩
【申请人】中国计量学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年1月7日