一种旱柳优树花粉离体萌发培养基及用于测定旱柳花粉活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种旱柳优树花粉离体萌发培养基及测定旱柳花粉活力的方法，属于 生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 旱柳（Salix matsudana Koidz)为杨柳科、柳属乔木。旱柳枝条柔软，树冠丰满， 是中国北方常用的庭荫树、行道树。常栽培在河湖岸边或孤植于草坪，对植于建筑两旁。亦 用作公路树、防护林及沙荒造林，农村"四旁"绿化等，是早春密源树种。防护林及绿化树 种，亦可作用材树种。树形美，易繁殖，深为人们喜爱。其柔软嫩绿的枝条、丰满的树冠及稍 加修剪的树姿，更加美观。适合于庭前、道旁、河堤、溪畔、草坪栽植。在北方园林，柳属的一 些绿化树种是落叶树种中绿期最长的一种。为了妥善保存和合理利用山东的柳树资源，我 们自2012年以来对山东各地的柳树资源进行了全面调查，重点调查了年龄较大的乔木柳 树，共选择优树（Plus tree) 96株，其中83株为旱柳，并进行了系统研究。
[0003] 柳树花粉包含的基因类型，具有丰富的遗传多样性，是种质保存和交换以及杂交 育种的重要材料。在柳树的杂交育种工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础 性工作。柳树雄雌异株，为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难，更需要保存花粉 的活力。在使用采集和贮存花粉之前，通常要做花粉生活力的鉴定。因此，掌握柳树花粉 生活力的测定方法，对于提高柳树育种效率具有较高的实际应用价值。
[0004] 花粉是自然条件下的种子植物进行杂交遗传信息交流的载体，了解花粉活力的测 定方法和花粉保存的条件，有助于进行杂交育种的相关工作。花粉生活力随植物品种不同 而不同，同时随外界温度、湿度、贮藏方式与方法等的影响而变化。测定花粉生活力的方法 有很多种，如形态检验法、染色检验法、无机酸测定法、活体萌发测定法、田间授粉检验法等 (王文莉，2004)，检验方法不一样，测定出的花粉活力也有一定的差异。
[0005] 花粉离体萌发与花粉管显微观测的结果较为稳定，更能反应花粉的发育状况和实 际活力，被认为是效果最好、最接近原始结果的方法（赵宏波等，2007)。但花粉离体萌发需 要适宜的培养基，否则也难以取得理想的效果。不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓 度不同，往往要对基本培养基进行筛选或改良。目前，关于旱柳花粉离体培养的培养基和培 养条件还未见报道。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种旱柳优树花粉离体萌发培养基及其 用于测定旱柳花粉活力的方法，通过筛选、改良培养基，优化培养条件，解决旱柳花粉离体 萌发率低的问题，使得旱柳花粉的萌发率得到大幅度提高，从而提供可靠、有效的测定旱柳 花粉活力的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种旱柳优树花粉离体萌发培养基，是以蒸馏水为溶剂，其成分含有8_12g/L的 琼脂、140-160g/L的蔗糖和0· 1-0. 3g/L的硼酸。
[0009] 优选的，该旱柳优树花粉离体萌发培养基，是以蒸馏水为溶剂，其成分含有10g/L 的琼脂、150g/L的蔗糖和0. 2g/L的硼酸。
[0010] 本发明的旱柳优树花粉离体萌发培养基的制备方法，步骤如下：
[0011] 将琼脂加入到蒸馏水中，隔水加热，溶解后，加入蔗糖和硼酸，搅拌后即成灭菌培 养液；将配好的灭菌培养液趁热用取样器滴一滴于载玻片凹槽中央，使其慢慢扩散成一略 带弧度的平面且基本完全铺满凹槽，弧面需尽量薄，冷凝后即为旱柳花粉离体萌发培养基。
[0012] 上述旱柳优树花粉离体萌发培养基用于测定旱柳花粉活力的方法，包括以下步 骤：
[0013] ⑴花粉采集
[0014] 选取发育正常、无病虫危害、生长健壮的旱柳植株，从树冠中上部剪取直径 1-2. 5cm、长1-1. 5m的花枝，在温度20-25°C，相对湿度60-70%条件下水培；待雄花序下端 有少量的熟花粉散落时，收集花粉，放入干燥器内，于〇_5°C条件下贮藏；
[0015] (2)花粉离体培养
[0016] 将花粉从干燥器中取出，在0_5°C的温度和50-90%的相对湿度条件下，使其吸水 20-28h，将吸水后的花粉均匀撒在位于载玻片上的旱柳花粉离体萌发培养基上，然后将载 玻片置入有湿润滤纸的培养皿内，并置于25°C的恒温光照培养箱中培养；
[0017] (3)花粉活力的测定
[0018] 保持上述温度条件促使花粉管生长，离体培养4-10h后，将载玻片在显微镜下观 察，进行花粉萌发率统计，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次 以上，每重复随机观察3~5个视野，统计花粉萌发率以反映有活力的花粉所占比例。
[0019] 步骤⑵中，花粉的吸水时间优选为24h。
[0020] 步骤（2)中，恒温光照培养箱的培养条件为：培养温度为25°C，光照强度为 50001x〇
[0021] 步骤（3)中，花粉萌发率的计算公式为：花粉萌发率（％) =(萌发花粉数/总花 粉数）X 100%。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] (1)本发明通过对离体萌发培养基的组成和花粉离体的培养条件进行了筛选和优 化组合，从而更加适合于旱柳花粉的离体萌发和正常生长，旱柳优树花粉在本发明的旱柳 花粉离体萌发培养基上，温度25°C，光照强度为50001χ的条件下培养，旱柳优树花粉萌发 最好，花粉管也能得到较好的生长。
[0024] (2)与原有的鉴定方法如石蜡切片、形态观察等相比，本发明利用该旱柳优树花粉 离体萌发培养基与花粉管生长显微观测技术测定花粉活力的测定结果更加稳定可靠，花粉 萌发率反应有活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒发育是否正常及生 理状况的优劣，为旱柳花粉活力的测定提供了一种更加有效、可靠的方法。经筛选、改良、优 化组合和条件后，旱柳优树新鲜花粉的萌发率最大可接近70%，远高于原有文献的报道。
【附图说明】
[0025] 图1为水培旱柳（商10)的雄花枝；
[0026] 图2为旱柳（商19)花粉低温冷藏24h培养6h的花粉萌发情况；
[0027] 图3为旱柳（垦1)花粉低