L-苏氨酸基因工程生产菌的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种L-苏氨酸基因工程生产菌。
【背景技术】
[0002] L-苏氨酸作为八种必需氨基酸之一，在人和动物的生长发育中起着重要的作用， 因而被广泛用于饲料添加剂、食品工业及医药产品等方面。
[0003] L-苏氨酸的制备方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、酶法和发酵法，前三种方 法都由于存在着诸多弊端，不能实现工业化生产。而发酵法由于成本低、污染小等优点，已 成为生产L-苏氨酸的主要方法。
[0004] 上世纪50年代，日本最早采用添加前体物的方法通过发酵来生产苏氨酸，在60年 代已有通过直接发酵法生产L-苏氨酸的报道，是利用诱变育种筛选的黄色短杆菌通过发 酵生产出L-苏氨酸。上世纪70年代末，苏联已开始用基因工程菌大规模生产L-苏氨酸。
[0005] 传统的发酵法大多采用诱变的黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌等，通过解除菌体自身 的反馈调节，切断支路代谢，增加前体物的合成等手段，以提高L-苏氨酸产量。Shiio (Isamu Shiio and Shigeru Nakamori. Agr Bio Chem. 1969, 33(8) :1152)等利用黄色短杆菌，经 α -氨基-β -羟基戊酸处理后，获得了 L-苏氨酸生产菌株，苏氨酸的产量累积达13. 58g/ L0
[0006] Nakamori 等(Shigeru Nakamori and Isamu Sh i i ο. Agr Bio Chem. 1972, 36 (7) : 1209)在此菌株基础上，选育出了 L-蛋氨酸缺陷型变异株，产量提高到 了 18g/L。但传统诱变育种由于随机性较强，获得高产突变株的难度较大。
[0007] 利用合理的代谢工程方法构建L-苏氨酸工程菌，是目前获得高产菌株的首选方 法。日本味之素2002年申请的中国专利CN01137078. 5中，利用大肠杆菌，通过增强苏氨酸 合成代谢途径上相关基因的表达，使苏氨酸产率达〇. 43g/g (葡萄糖，糖酸转化率为43% )， 但发酵过程中需要额外添加 L-甲硫氨酸。Kwang Ho Lee (Kwang Ho Lee, Jin Hwan Park, Tae Yong Kim, et al. Mol Syst Biol. 2007 ;3:149)等利用代谢工程手段，使编码天冬氨酸激酶 I和III的thrA和IysC基因发生突变，解除了末端产物反馈抑制；同时失活tdh和突变 ilvA基因使苏氨酸不被降解；失活metA和IysA基因，为苏氨酸合成提供了更多前体，最终 通过分批发酵培养，产酸率达0. 393g/g (葡萄糖，糖酸转化率为39. 3 % )，但发酵过程中需 要添加 L-蛋氨酸和L-赖氨酸，这增加了工业化生产成本。
[0008] 因此，人们一直渴望得到这样一种L-苏氨酸生产菌株，在其发酵过程中无需添加 合成前体比如氨基酸，通过直接发酵就可以得到高产率的L-苏氨酸。
【发明内容】
[0009] 为了克服现有L-苏氨酸生产技术的上述缺陷，得到理想的L-苏氨酸生产菌，本发 明利用基因工程技术来改造大肠杆菌，通过增强与L-苏氨酸产生相关的基因，并且弱化分 支代谢途径，获得一株高产L-苏氨酸的生产菌株。在其发酵过程中，不需要添加任何氨基 酸，就能有效地积累L-苏氨酸，从而降低生产成本，因此具有广阔的工业化应用前景。
[0010] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-苏氨酸生产菌。
[0011] 本发明的第二个目的在于提供一种L-苏氨酸生产菌的构建方法。
[0012] 本发明的第三个目的在于提供所述L-苏氨酸生产菌用于生产L-苏氨酸的应用。
[0013] 本发明的第四个目的在于提供一种生产L-苏氨酸的方法。
[0014] 为了达到上述目的，本发明对于原始大肠杆菌中与L-苏氨酸代谢途径相关的基 因进行了系统的研究和筛选，并且设计出包括如下步骤的基因工程菌构建方案：
[0015] A.敲除原始菌株中的在L-苏氨酸代谢途径中某些不利于L-苏氨酸合成和外运、 或者促使L-苏氨酸降解的基因，获得基因敲除菌株，被敲除的基因选自tdh、tdcC和thrL 中的一个或多个；
[0016] B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的在L-苏氨酸代谢途径中某些有利于L-苏 氨酸合成和外运、或者阻断L-苏氨酸降解的基因的表达，获得基因增强菌株，被增强的基 因选自thrA*BC(G433R)和rhtC中的一个或多个；
[0017] C.将串联表达的？口(3、38口44拉48、让^*(64331?)和178〇0'3421)基因以单拷贝 或多拷贝的方式插入到步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株的基 因组中，获得L-苏氨酸生产菌。
[0018] 通过上述基因工程构建和大量的筛选，得到一种高产L-苏氨酸的菌株，现保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015556。
[0019] 该L-苏氨酸生产菌CCTCC M 2015556是通过包括以下步骤的方法构建出来的：
[0020] A.敲除作为原始菌株的大肠杆菌MG1655中的基因 tdh、tdcC和thrL，获得基因敲 除囷株；
[0021] B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的基因 thrA*BC(G433R)和rhtC，使这些基 因过表达，获得基因增强菌株；
[0022] C.构建包含过表达原始菌株中的基因 ppc、aspA、pntAB、thrA* (G433R)和 lysC*(T342I)的重组质粒（命名为pl5K-Thr);
[0023] D.将步骤C中所述重组质粒上的基因以单拷贝或多拷贝的方式插入到步骤B中所 述基因增强菌株的基因组中，获得基因工程菌CCTCC M 2015556。
[0024] 根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌CCTCC M 2015556在L-苏氨酸 的生产中的应用。
[0025] 在上述应用中，通过上述基因工程生产菌的直接发酵生产L-苏氨酸，无需在培养 基或发酵液中添加 L-苏氨酸的合成前体比如氨基酸。
[0026] 在优选的实施方式中，培养基或发酵液中不添加氨基酸。
[0027] 根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，NaCl 0. 8g/L， (NH4) 2S0422g/L，Κ2ΗΡ042· Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 8g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，FeSO4 · 7H20 0· 02g/L，盐酸硫胺 0· 002g/L，酵母粉 1.0 g/L，CaC0330g/L，pH7. 0。
[0028] 本发明所构建的L-苏氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加任何氨基酸，就能够 实现发酵过程中发酵液中L-苏氨酸的有效积累，提高了 L-苏氨酸的产量及糖酸转化率， L-苏氨酸产量可高达11. 27g/L，糖酸转化率达37. 6 %，因而具有广阔的工业应用前景。
[0029] 本发明构建的L-苏氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Escherichia coli，中文 名称是大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2015年9月18日，保藏 地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M 2015556。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明构建的重组质粒pl5K_Thr的示意图，其过表达ppc、aspA、pntAB和 thrA*(G433R)基因。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说 明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0032] 本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明 外，皆指质量百分含量。
[0033] 在本文中，对于本发明，术语"L-苏氨酸基因工程生产菌"、"L-苏氨酸生产菌"、"基 因工程菌"、"L-苏氨酸基因工程菌"、"生产L-苏氨酸的基因工程菌"、"CIBTS1792菌株"、 "大肠杆菌CIBTS1792"表示相同的意义，都是指L-苏氨酸生产菌CCTCC M 2015556。
[0034] 在本发明中，术语"大肠杆菌MG1655"、"菌株MG1655"、"MG1655"表示相同的意义。
[0035] 本发明中涉及的基因名称解释如下：
[0036] tdh :L-苏氨酸3-脱氢酶；
[0037] thrL :苏氨酸操纵子前导肽；
[0038] thrA :天冬氨酸激酶及I-高丝氨酸脱氢酶；
[0039] rhtC :苏氨酸转运体；
[0040] IysC :天冬氨酸激酶；
[0041] tdcC :L_苏氨酸/L-丝氨酸转运体；
[0042] dacA :D_丙氨酰-D-丙氨酸駿肽酶；
[0043] thrB :高丝氨酸激酶；
[0044] thrC :苏氨酸合成酶；
[0045] yihF :DU945 家族蛋白；
[0046] ppc :磷酸烯醇式羧化酶；
[0047] aspA :天冬氨酸氨裂解酶；
[0048] pntAB :吡啶核苷酸转氢酶。
[0049] cadB :赖氨酸：尸胺反向转运体；
[0050] yidj :假定的硫酸脂酶；
[0051] thrA*BC :苏氨酸抗反馈操纵子（feedback-resistant threonine operon) 〇
[0052] 众所周知地，基因名称后标注星号代表该基因的变体，比如：thrA*(G433R)是 指第433位甘氨酸（G)突变成精氨酸（R)的天冬氨酸激酶及I-高丝氨酸脱氢酶的基因 thrA 的突变体；IysC* (T342I)是指第342位苏氨酸（T)突变成异亮氨酸（I)的天冬氨酸激酶的 基因 IysC的突变体；thrA*BC(G433R)是指thrA第433位甘氨酸（G)突变成精氨酸（R)的 苏氨酸抗反馈操纵子的基因的突变体。
[0053] 本发明在设计基因工程菌的构建方案中，根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢途径， 在大肠杆菌MG1655上构建了一系列突变体，如：基因 tdh、tdcC和thrL等的敲除或失活； thrA*BC和rhtC的增强及IysO的突变。其中tdh的敲除阻断了 L-苏氨酸的降解，tdcC 的敲除可增加 L-苏氨酸的外运，thrL的敲除去除了转录衰减调控，thrA*BC的过表达增强 了 L-苏氨酸的合成，rhtC的过表达增强了 L-苏氨酸的外运，IysC*的突变增加了前体的供 应从而有利于L-苏氨酸的合成。在这些突变体中整合表达ppc、pntAB、aspA、asd、thrA* 等，构建了一系列的L-苏氨酸基因工程菌。
[0054] 至于大肠杆菌MG1655突变菌株的构建方法，参考Kwang Ho Lee等报道的 文献(Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production, Kwang Ho Lee, Jin Hwan Park, et al. Molecular Systems Biology3, 2007)， 利用 Yang JJ 等报道的文献的方法（High-Efficiency Scarless Genetic Modification in Escherichia coli by Using Lambda Red Recombination and I-SceI Cleavage, Yang JJ，et al.Appl Environ Microbiol，2014)进行大肠杆菌基因组中 tdh、thrL 和 tdcC 等基 因的敲除及thrA*BC、rhtC和IysO等基因的过表达。
[0055] 实施例
[0056] 以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50 μ g/ml，所述壮观霉素在 培养基中的终浓度为50 μ g/ml，所述氨苄霉