一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 由于化石能源危机日趋严重以及利用化石能源带来的环境问题，制造生物燃料成 为迫切问题。随着生物柴油的大量生产，产生了大量副产物甘油。据估计，每生产10吨生 物柴油大约生成1吨粗甘油。甘油可以作为低廉的可再生原料，用来生产化学品和燃料，可 以带来巨大经济和环境效益。
[0003] 丙烯酸（CH2 = CH-C00H)是一个重要的不饱和有机酸和化学工业原料。它可以广 泛的应用在聚凝剂、分散剂、油漆和涂料方面，还能作为皮革、造纸、纺织中的粘合剂。同时， 丙烯酸的聚合物，例如超吸水性分子材料的应用，进一步推动了丙烯酸的需求。
[0004] 丙烯酸可以通过化学合成获得，但是化学合成途径具有原料有限、成本居高不下 以及容易造成环境污染等问题；与化学合成法相比，生物合成操作简单、条件温和、绿色环 保。越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。
[0005] 已知一些微生物可以在代谢中间过程产物微量丙烯酸作为中间体，包括丙酮丁醇 梭菌（Clostridium propionicum)、金属硫化叶菌（Sulfolobus metallicus)、埃氏巨球 型菌（Megasphaera elsdenii)、澄色绿曲烧菌（Chloroflexus aurantiacus)，布氏酸菌 (Acidianus brierleyi)和脱硫弧菌丙稀酸菌（Desulfovibrio acrylicus)等，但是，以上 微生物大部分属于厌氧的无机自养型细菌，难以培养，代谢途径不清，不易进行生物改造。 目前，微生物产丙稀酸的研究主要是利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium propionicum)作为 宿主菌实现，但是该菌的生物发酵产量低，且不能进行有效改造。同时，现有技术中尚没有 一种以模式菌株大肠杆菌为宿主菌，以甘油为底物生产丙烯酸的重组菌。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了 一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌，所采取的技 术方案如下：
[0007] 本发明的目的在于提供一种利用甘油生产丙烯酸的重组菌。该重组菌过表达甘油 脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙醛脱氢酶基因。
[0008] 优选地，所述甘油脱水酶基因，为来源于肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因 dhaB123 ;所述甘油脱水酶再激活酶基因，为来源于肺炎克 雷伯氏菌的甘油脱水酶再激活酶基因 gdrAB ;所述3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因，为来源 于橙色绿曲烧菌（Chloroflexus aurantiacus)的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 pcsll; 所述丙醛脱氢酶基因，为来源于沙门氏菌（Salmonella typhimurium)的丙醛脱氢酶基因 pduP〇
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种所述重组菌的构建方法，该方法的步骤如下：
[0010] 1)克隆获得甘油脱水酶基因 dhaB123,甘油脱水酶再激活酶基因 gdrAB，3-羟基丙 酰辅酶A脱水酶基因 pcsll和丙醛脱氢酶基因 pduP ;
[0011] 2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 pcsll和丙醛脱氢酶基因 pduP 连接到质粒载体上，获得重组质粒；
[0012] 3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因 dhaB 123和甘油脱水酶再激活酶基因 gdrAB 插入到宿主菌的丙酸调节子基因 PrpR座位上，得到宿主重组菌；
[0013] 4)将步骤2)所得的重组质粒导入到步骤3)所得的宿主重组菌中，获得重组菌。
[0014] 优选地，步骤1)所述克隆甘油脱水酶基因 dhaB123所用引物如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示；所述克隆甘油脱水酶再激活酶基因 gdrAB所用引物如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；所述克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 pcsll所用引物如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；所述克隆丙醛脱氢酶基因 pduP所用引物如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示。
[0015] 优选地，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。
[0016] 优选地，步骤3)所述宿主菌为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0017] 所述方法的具体步骤如下：
[0018] 1)以肺炎克雷伯氏菌的DNA为模板，分别以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示 和SEQ ID NO. 3-SEQ ID勵.4所示的引物克隆甘油脱水酶基因(11^8123和甘油脱水酶基 因 dhaB123;以橙色绿曲挠菌DNA为模板，以如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示的引物克隆 3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 pcsll;以沙门氏菌的DNA为模板，以如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示的引物克隆丙醛脱氢酶基因 pduP ;
[0019] 2)将步骤1)所得的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 pcsll和丙醛脱氢酶基因 pduP 连接到质粒pETDuet-Ι上，获得重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP ;
[0020] 3)将步骤1)所得的甘油脱水酶基因 dhaB 123和甘油脱水酶再激活酶基因 gdrAB 插入到大肠杆菌的丙酸调节子基因 prpR座位上，得到宿主重组菌；
[0021] 4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-pcsII-pduP导入到步骤3)所得的宿主 重组菌中，获得重组菌。
[0022] 所述重组菌可以在发酵生产丙烯酸中的应用。
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述重组菌发酵生产丙烯酸的方法，该方法 的步骤如下：
[0024] 1)活化权利要求1或2所述的重组菌，获得活化重组菌；
[0025] 2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素的M9液体培养基中进行发 酵培养。
[0026] 优选地，上述方法中步骤2)所述发酵培养，是按1 %的接种量接种，在37 °C， ISOrpm的条件下培养至OD6。。达到1. 0时，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导和维生素 B 12，每隔 12h添加一次异丙基硫代半乳糖苷和抗生素 IPTG，异丙基硫代半乳糖苷诱导后48h终止发 酵。
[0027] 所述重组载体导入宿主菌的方法采用热激转化法。
[0028] 本发明获得的有益效果如下：
[0029] 本发明以E. coli宿主菌，实现了以甘油为底物，在大肠杆菌这种模式菌株中首次 合成得到丙烯酸，为丙烯酸的生产提供了新的技术方法。
[0030] 本发明通过在大肠杆菌prpR基因座位处插入外源的甘油脱水酶基因（dhaB123) 和甘油脱水酶再激活基因（gdrAB)到宿主E. coli上过表达，同时过表达外源的3-羟基丙 酰辅酶A脱水酶基因（pcsll)和丙醛脱氢酶基因（pduP)实现以甘油为碳底物生产发酵产 丙烯酸。
[0031] 定义和缩写
[0032] 在本发明中使用下列的缩写或简称：
[0033] 甘油脱水酶基因：dhaB123
[0034] 甘油脱水酶再激活酶基因 ：gdrAB
[0035] 3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因 ：pcsll
[0036] 丙醛脱氢酶基因：pduP
[0037] 丙酸调节子：prpR
[0038] 大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli) :E. coli
[0039] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) :Κ· penumoniae
[0040] 沙门氏菌（Salmonella typhimurium) ：S. typhimurium [0041 ] pETDuet-1-pcsII-pduP 载体：pETDuet-1-pp 质粒
[0042] "基因插入"指将目标基因从基因组特定座位处插入到基因组中，从而使宿主菌携 带某种特定基因表达其对应功能的蛋白质。
[0043] "热激转化"或"热转化"指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到 宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或 将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。
[0044] "过量表达"或"过表达"指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平 (即，野生型表达水平），可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
【附图说明】
[0045] 图1为利用甘油合成丙烯酸的代谢途径示意图。
[0046] 图 2 为 pETDuet-1-pcsII-pduP 载体构建示意图。
[0047] 图3为重组大肠杆菌发酵产物丙烯酸的高效液相色谱检测；
[0048] (A为标准品，B为菌发酵产物）。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0050] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0051 ] 所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所 用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无 特别说明均用去离子水配制。
[0052] 培养基配方：
[0053] 1)种子液摇瓶培养基
[0054] LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121°C，20min灭菌。
[0055] 2)发酵生产摇瓶培养基
[0056] M9 改良培养基：40g/L glycerol，I. 5g/L KH2PO4, 3g/L(NH4)2S04, lg/L - 水合柠 檬酸，lg/L 二水合柠檬酸三钠，I. 9g/L KC1，3g/L MgSO4, 0· 138g/L FeSO4 · 7Η20,4· 5mg/L vitamin BI和100 μ L微量元素。
[0057] 微量元素（每升）：3. 7g (NH4) 6Μ〇7024 ·4Η20, 2. 47g Η3Β04, I. 58g MnCl2 ·4Η20, 0· 29g ZnSO4 · 7Η20, 0· 25g CuSO4 · 5Η20。
[0058] 在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定 性，如100mg/L的氨苄青霉素，每隔12h添加维生素 B12用于甘油脱水酶（DhaB123)发挥作 用。
[0059] 实施例1外源基因的克隆
[0060] 丙醛脱氢酶基因（pduP) (Gene ID: 1253572)的克隆是以S. typhimurium为模板， 通过PCR扩增获得，引物序列如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所说，（引物：5' -GGAATTCCATA TGAATACTTCTGAACTCGAAAC-3' 和 5' -CGGGGTACCTTAGCGAATAGAAAAGCCGTTG-3'），再利用回收 试剂盒回收目的片段。
[0061] 3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因（pcsll)的克隆是以Chloroflexus aurantiacus 为模板，克隆丙酰辅酶A合成酶基因（pcs) (AF445079)的阅读框区域2566bp-3552bp，该区 域为pcs水合酶编码功能域，通过PCR扩增获得