融合多肽的重组工程菌株及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 在基因工程领域，本发明公开了一种以大肠杆菌为载体的重组工程菌，同时涉及 工程菌株的构建及其应用。
【背景技术】
[0002] 促性腺激素释放激素（GnRH)是一种由十个氨基酸残基组成的肽类激素，其结构 为 PGlul-His2-Trp3-Ser4-Tyr 5-Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly lti-NH2a GnRH 最早发现于下丘脑的 神经内分泌细胞中，它以脉冲的方式释放，与垂体上的GnRH受体特异地结合，刺激黄体生 成激素（LH)和卵泡刺激素（FSH)的合成与释放。LH和FSH再促进性腺释放特异性激素，如 女性刺激卵巢分泌雌二醇和孕酮，男性刺激睾丸分泌睾酮和前列腺素，并对乳腺、肾上腺皮 质、甲状腺和骨骼生长也发挥作用。除了下丘脑的神经内分泌细胞分泌GnRH，许多恶性肿瘤 组织如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤等也能够自分泌这种激素。GnRH是一种小分子半 抗原，免疫原性很弱，单独将其作为疫苗很难引起免疫应答。
[0003] 研究表明，当将GnRH连接在一些大分子载体上免疫动物会引起特异性表位抑 制。因而本实验室利用辅助T表位来提高GnRH的免疫原性。麻疹病毒融合蛋白序列中 第288位氨基酸到第302位氨基酸片段是一个典型的T细胞表位（SEIKGVIVRLEGVAK，下 文均简称MVP)，可用于人用疫苗中。国外已有报道，用MVP与半抗原相连构成杂合肽，能 诱导出针对半抗原的抗体反应，而且不会产生明显的针对该T细胞表位的抗体。此外，研 究表明含有多拷贝线性连接的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到极大的提高，因而， 本实验室将编码三段首尾相连的GnRH的核苷酸片段克隆入高效表达载体。还有研究表 明，半抗原的二聚体能产生很强的免疫原性。人IgG1铰链区（hinge region)寡肽片段 226-232/226'-232'（CPPCPAP/CPPCPAP)是天然免疫蛋白的枢轴。在天然蛋白中，这个富含 脯氨酸的刚性双链环状结构会自发折叠成一个双聚脯氨酸-Π α螺旋，人工合成的铰链区 多肽225-232/225' -232'的空间构型与天然蛋白中铰链片段的构型完全一致，进一步研究 还发现在IgG1铰链区的一端或两端连上非IgGl的多肽序列时，仍能形成双聚脯氨酸-II α 螺旋。因此，我们在hinge region片段N末端加上三段重复的GnRH片段，在它的C末端连 接麻疹病毒的T表位，希望GnRH能藉此形成二聚体，增强免疫原性。
[0004] 热休克蛋白家族的mHSP70中的407-426片段（M)作为HSP70主要的非特异性免 疫增强肽段，能通过上调DC表面的共刺激分子和MHC分子，促进Thl型刺激反应，增强了杀 伤细胞的细胞毒作用，从而介导强烈的细胞免疫应答；同时通过与CD40结合而增强mHSP70 或CD40L诱导的DC成熟，从而高效地摄取、加工处理和递呈抗原，诱导特异性的细胞毒性T 淋巴细胞生成。本实验室前期研究发现M经过串联重复两次（M2)后能够加强对DC的刺激 效果，具有较好的抗肿瘤活性。
[0005] 但是重组GnRH多肽只有50多个氨基酸，如果直接在大肠杆菌表达效率很低，因为 其mRNA和表达产物都易降解。因此可以采取融合表达的方法解决这一问题，选择本实验室 已有的表达系统PED。在这一系统中，融合伙伴ansB-C与目的活性肽由氨基酸序列Asp-Pro 连接，其中，Asp-Pro是唯一的酸水解位点。融合蛋白在酸性条件下，Asp-Pro之间的肽键断 开，从而释放出目的多肽。
[0006] 为了进一步增强GnRH3-hinge-MVP多肽的抗肿瘤活性，本发明构建了 GnRH/M2基因 重组菌，表达纯化融合蛋白后同APC体外共培养获得DC疫苗，回输体内可促使APC具有较 高的装载和处理抗原能力，可提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，达到识别和杀灭肿瘤细胞 的目的，进一步增强抗肿瘤作用。
【发明内容】
[0007] 本发明公开一种重组大肠杆菌菌株PEDGM2。
[0008] 本发明的一个目的是提供重组菌的构建方法。
[0009] 本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的用途。
[0010] 在本发明的第一个方面，提供了一种重组大肠杆菌工程菌株。该大肠杆菌工程 菌株命名为BL21/pEDGM2,菌株已提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国.武 汉·武汉大学，保藏日期2015年6月14日，保藏编号为CCTCC NO :M 2015369,分类命名： Escherichia, coli BL21/pEDGM2。该菌株携带有能表达 &11813?11冊3-11；[1^6-]\^?-]\12融合 蛋白的重组质粒。
[0011] 在本发明的第二个方面，提供了重组大肠杆菌菌株pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge -MVP-M2的构建及其所表达的重组蛋白的纯化方法，其技术路线详述如下：
[0012] L 重组质粒 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2及相应工程菌的构建
[0013] 以本实验室构建的 PED⑶(pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG)为 模板，设计上游引物Pl和下游引物P2,上游含有Nco I酶切位点，下游引入Nhe I位 点。将扩增的ansB-C-GnRH3-hinge-MVP序列与空的pET28a质粒连接，获得重组质粒 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP〇
[0014] 以本实验室构建的pET28a-hVEGF121 I-M2为模板，设计上下游引物Vl 和V2,两端分别引入Nhe I位点和Hind III位点。PCR反应扩增M2序列。将 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP质粒和获得的M2序列用Nhe I和Hind III限制性内切 酶进行双酶切，再加入DNA连接酶获重组质粒pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M 2。将重 组质粒转化至E. coli BL21感受态细胞，卡那霉素筛选阳性转化子，用引物Pl和V2验证。
[0015] 经 DNA 测序分析显示，M2片段正确插入到了 pET-28a-ansB-C-GnRH 3-hinge-MVP (P EDG)重组质粒中，并且位于pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP基因片段的3'端。至此两 段目的基因片段按照正确的顺序插入pET-28a中，并组成融合蛋白的重组基因片段，pET-2 8a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP_M2表达载体构建完成并且测序分析正确。
[0016] 2.融合蛋白的诱导表达和分离纯化
[0017] 从平板上挑取工程菌单菌落，接种至含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培 养过夜，按1 %转接于新鲜LB培养液中，37°C培养至对数生长期，加入乳糖进行诱导表达， 37°C继续培养，5h后离心收取菌体沉淀。
[0018] 收集菌体，充分裂解菌体，12000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀。沉淀经过洗 涤，得到纯净的包涵体，包涵体粗品加入8mol/L尿素至包涵体完全溶解。将包涵体溶液进 行无水乙醇分级沉淀，收集沉淀；将乙醇沉淀的蛋白加入60mM的HC1，置48°C水浴72h。
[0019] 将水浴后的蛋白溶液过阴离子交换柱DEAE-cellulose做进一步纯化，用含NaCl 的层析缓冲液梯度洗脱，收集穿透峰和洗脱峰，检测合并目的蛋白峰组分，对蒸馏水充分透 析后冻干保存。
【附图说明】
[0020] 图1重组质粒构建原理示意图。
[0021] 图2 PCR获得GnRH重组基因的1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0022] Lanel :DNA Marker，Lane2 :PCR 产物。
[0023] 图3 L 5 %琼脂糖凝胶中pET28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP重组质粒的PCR验证
[0024] Lanel :DNA Marker，Lane2 :PCR 产物。
[0025] 图4 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP重组质粒的基因正向测序图。
[0026] 图5 PCR获得M2基因的1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0027] Lane I :DNA Marker，Lane2 :PCR 产物。
[0028] 图6 0. 8%琼脂糖凝胶中重组质粒的限制性内切酶验证电泳图
[0029] Lanel :DNA Marker，Lane2 :经 Hind III 单酶切后的重组质粒，Lane3 :经 Nhe I 和 Hind III双酶切后的重组质粒，Lane4 :未经酶切的重组质粒。
[0030] 图 7 L 5 %琼脂糖凝胶中 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2重组质粒的 PCR验 证
[0031] Lanel :PCR 产物，Lane2 :DNA Marker。
[0032] 图 8 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2重组质粒的基因正向测序图。
[0033] 图9 12% SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。
[0034] Lanel :Protein Marker，Lane2 :诱导前的全菌蛋白样品，Lane3_10 :诱导后 1-8 小 时每个小时的全菌蛋白样品。
[0035] 图10 12% SDS-PAGE电泳检测超声裂解菌体结果。
[0036] Lanel :Protein Marker，Lane2 :诱导前的全菌蛋白样品，Lane3 :诱导后5h全菌蛋 白样品，Lane4 :菌体裂解上清，Lane5 :菌体裂解沉淀。
[0037] 图11 12% SDS-PAGE电泳检测乙醇分级沉淀融合蛋白结果。
[0038] Lanel :乙醇沉淀前，Lane2 :加入0. 5倍体积无水乙醇的蛋白沉淀，Lane3 :加入1 倍体积无水乙醇的蛋白沉淀，Lane4 :加入2倍体积无水乙醇的蛋白沉淀。
[0039] 图12 12% tricine-SDS-PAGE电泳检测酸水解目的蛋白结果
[0040] Lanel :Protein Marker，Lanel :酸水解前的融合蛋白，Lane3 ~8 :酸水解后 12h、 24h、36h、48h、60h、72h 取样。
[0041] 图13 12% tricine-SDS-PAGE电泳检测DEAE52阴离子交换层析对目的蛋白纯化 结果。
[0042] Lanel :Protein Marker，Lane2 :上样前的蛋白样品，Lane3 :穿透峰峰顶时的蛋白 样品，Lane4 :洗脱峰峰顶时的蛋白样品。
【具体实施方式】
[0043] 材料
[0044] (1)菌株和质粒
[0045] 载体pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli BL21(DE3); pET-28a-hVEGF121 I-M2, Escherichia coli BL21(DE3)，pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MV P-NRLLLTG和pET-28a-hVEGF121 I-M2质粒均为本实验室保存。
[0046] (2)酶和试剂
[0047] 分子克隆工具酶为TaKaRa公司产品；质粒抽提试剂盒为上海捷瑞生物工程有限 公司产品；PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。
[0048] (3)培养基
[0049] LB 培养基，配方见参考文献 Sambrook J，FristshE F，Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY ：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989〇
[0050] 本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连 接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J， FristshE F，Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Man ual 2nd ed. NY ：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989,pp.16-340。
[0051] 实施例1携带有目的基因 ansB-C-GnRH3-hinge-MVP的质粒载体的构建
[0052] I. 1模板质粒PED⑶和空质粒pET28a的提取
[0053] 将本实验室构建的 PED⑶(pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-