鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养及重新分离的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养及 重新分离的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌是引起鸭疫里默氏杆菌病的病原菌，鸭疫里默氏杆菌病导致幼鸭 急性或慢性败血性传染，是严重危害全世界养鸭业的一种主要疾病，而大肠杆菌是造成家 禽养殖业经济损失最严重的细菌病的病原体。
[0003] 临床上鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌常混合感染，两种菌均能使不同品种、日龄及 性别的鸭感染发病，发病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征性病理变化， 临床诊断很难将两者区分开来，并且感染两病的鸭群死亡率高，淘汰率高，对养鸭业造成极 大经济损失。
[0004] 临床上常发现两种菌之间存在耐药性转移现象，但是在体外培养过程中，由于大 肠杆菌短时间内便以其竞争优势迫使鸭疫里默氏杆菌停止生产，进而阻断了二者共同生长 的进程，导致无法进行深入研究。这可能是因为在体内的细菌生长环境有其特殊的机制，导 致二者长期共同生长进而产生耐药性转移。如何在体外创造一种环境让二者能够生长20 代以上，从而使耐药性传递（或融合性研究）研究成为可能，具有重要的研究意义。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种操作简单、为探讨鸭疫里默氏杆菌 与大肠杆菌在共生条件下的耐药性转移及相关机制提供条件的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆 菌混合培养及重新分离的方法。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养及重新分离的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)菌种复苏：
[0009] 将冻干保存的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌菌种分别接种于对应的培养基中，进行 菌种复苏，制得复苏后的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌；
[0010] (2)筛选对抗生素敏感性差异的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌：
[0011] 对步骤（1)得到的复苏后的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌，采用药物敏感性试验筛 选出对某种抗生素敏感性差异的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌；
[0012] (3)混合培养：
[0013] 将步骤（2)筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌接种于培养基中，即可对鸭疫里 默氏杆菌与大肠杆菌进行混合培养9_12h，并制得混合培养菌液；
[0014] (4)测定步骤（2)中所选用抗生素对步骤（2)筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆 菌的最小抑菌浓度：
[0015] (5)制备抗生素板培养基：
[0016] 选取介于步骤（4)中测定的所选用抗生素对鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌的最小 抑菌浓度之间的抗生素浓度，制备抗生素平板培养基，备用；
[0017] (6)分离混合培养菌液：
[0018] 将步骤（3)制得的混合培养菌液进行稀释后，采用涂布平板法，在步骤（5)制得的 抗生素平板培养基中对稀释菌液中的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌进行培养20_24h，即可对 鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌进行分离。
[0019] 所述步骤（1)中菌种复苏的具体方法为：
[0020] (1-1)鸭疫里默氏杆菌菌种复苏：
[0021] 量取Iml生理盐水，将适量冻干保存的鸭疫里默氏杆菌菌种溶解混匀于生理盐水 中，制得鸭疫里默氏杆菌悬液，将制得的鸭疫里默氏杆菌悬液接种于含4%血清的胰蛋白胨 大豆琼脂培养基中后，置于〇)2培养箱中37°C下培养20-24h，然后从培养基中挑取单个菌 落接种于含4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在转速为150r/min、温度为37°C的摇 床上振荡培养20-24h，制得复苏后的鸭疫里默氏杆菌；
[0022] 所述鸭疫里默氏杆菌菌株由山东省农业科学院家禽研究所提供。
[0023] (1-2)大肠杆菌标准株菌种复苏：
[0024] 量取Iml生理盐水，将适量冻干保存的大肠杆菌菌种溶解混匀于生理盐水中，制 得大肠杆菌悬液，将制得的大肠杆菌悬液接种于营养肉汤培养基中，在转速为150r/min、温 度为37°C的摇床上振荡培养16-20h，制得复苏后的大肠杆菌；
[0025] 所述大肠杆菌菌种购自中国兽医药品监察所。
[0026] 所述步骤（2)药物敏感性试验所采用的方法为纸片琼脂扩散法，试验所用药敏纸 片中的抗生素为庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星中的任意一种，对应的药敏纸片 中庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的含量分别为10 μ g、5 μ g、5 μ g、10 μ g ;其中， 判定鸭疫里默氏杆菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星敏感的标准分别为抑菌圈 直径小于等于12mm、15mm、12mm、12mm，判定大肠杆菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟 沙星敏感的标准分别为抑菌圈直径大于等于15mm、21mm、16mm、17_。
[0027] 所述步骤（3)中混合培养的具体方法为：
[0028] 先量取步骤（2)筛选出的鸭疫里默氏杆菌接种至含4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤 养基中，在转速为150r/min、温度为37°C的摇床上振荡培养14-18h，至培养基见浑浊时，再 将步骤（2)筛选出的大肠杆菌接种于上述培养基中混合，在转速为150r/min、温度为37°C 的摇床上振荡培养9-12h，制得混合培养菌液。
[0029] 所述步骤（3)中混合培养的具体方法为：
[0030] (3-1)量取步骤（2)筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌，将量取的鸭疫里默氏 杆菌接种至含4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤养基中，将量取的大肠杆菌接种至胰蛋白胨大 豆肉汤培养基中；
[0031] (3-2)将步骤（3-1)中分别接种鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌的培养基分别在转速 为150r/min、温度为37°C的摇床上振荡培养16-20h ;
[0032] (3-3)将步骤（3-2)摇床振荡培养得到的鸭疫里默氏杆菌菌液稀释至 15 X 10sCFU/ml，大肠杆菌菌液稀释至I. 5 X IO3CFlVml ;
[0033] (3-4)吸取步骤（3-3)中制得的50 μ 1稀释后的鸭疫里默氏杆菌菌液与10 μ 1稀 释后的大肠杆菌菌液，并同时接种于4ml含4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在转速 为150r/min、温度为37°C的摇床上振荡培养9-12h，制得混合培养菌液。
[0034] 所述步骤（4)测定筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌对抗生素的最小抑菌浓 度的试验方法为试管双倍稀释法。
[0035] 所述步骤（5)制得的抗生素平板培养基为含4%血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养 基，对应选用的各抗生素，培养基中加入该抗生素的浓度分别为：庆大霉素10 μ g/ml，环丙 沙星3 μ g/ml，氧氟沙星6 μ g/ml，诺氟沙星6 μ g/ml。
[0036] 所述步骤（6)分离混合培养菌液的具体方法为：
[0037] 将步骤⑶制得的适量混合培养菌液稀释至3 X 103-6 X 103CFU/ml后，吸取100 μ 1 稀释液，涂布于麦康凯琼脂培养基、含4%血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基以及步骤（5)制 得的含庆大霉素的抗生素平板培养基中，置于CO2培养箱37°C下培养20-24h，即可对混合 培养菌液中的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌进行分离。
[0038] 本发明鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合培养及重新分离的方法，通过药物敏感性 试验筛选出对某种抗生素耐药的鸭疫里默氏杆菌，以及对该抗生素敏感的大肠杆菌，并采 用试管双倍稀释法测定筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌对该抗生素的最小抑菌浓度， 然后将筛选出的鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌以一定的时间间隔或者不同的浓度接种于含 4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，即可对鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌进行混合培养。 将混合培养的菌液稀释分别涂布于麦康凯琼脂培养基、含4%血清的胰蛋白胨大豆琼脂培 养基以及制得的含抗生素的抗生素平板培养基中进行培养，即可对这两种细菌实施再次分 离。本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌在体外混合培养以及重新分离的方法， 操作简单，在鸭禽体外使两种菌能够共同生长20代以上，为探讨二者在共生条件