一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法，属于生物技术与生 物工程领域。
【背景技术】
[0002] 随着工业迅速发展、人口急增等世界性问题的出现，造成了水质污染加剧，水资源 紧张。我国近几年来每年有600亿立方米工业污水和200亿立方米生活污水排放，长江、黄 河等七大水系遭到严重污染，生态湖水、近海地域水质也遭到不同程度的破坏，人民健康和 经济发展受到严重威胁，水资源保护形势严峻。我国是世界上最缺水的国家之一，人均淡水 资源仅为世界人均水平的四分之一。由于人口众多和社会发展，产生的大量工业和生活污 水使有限的水资源遭到严重污染。不少缺水的现象，让人触目惊心，水资源危机的警钟已经 敲响。《中华人民共和国水法》从立法的角度确立了保护水资源、节约用水、高效用水等法 律。水已经成为了最紧缺的资源。
[0003] 几十年来，化学絮凝剂在对保障人类社会、经济和生存环境的水资源的可持续性 利用中，在对地表水净化、污水处理方面发挥了巨大作用。但科学研究越来越多地发现：化 学絮凝剂具化学毒性和难以降解性质，其在使用后形成的残留和积累、迀移转化对人类健 康、生物多样性干扰和生态系统平衡方面产生严重危害。
[0004] 微生物絮凝剂是由微生物产生的天然生物大分子，具有生产条件温和、本质无毒 无害、使用高效、环境中生物可降解等特点，是环境友好性产品。微生物絮凝剂是新型生物 水处理剂，属当代新型发酵产品。对微生物絮凝剂的研究已成为世界学术研究的热点，科学 导向已使微生物絮凝剂形成了强烈的市场需求。2013年国务院《生物产业发展十二五规划》 中把新型发酵产品的产业化与推广应用；把大力发展高性能生物环保生物制剂列为重点发 展领域。但纵观近30年来微生物絮凝剂的研究现状，仍存在着菌种性能不好、生产基质不 经济、发酵工艺不够合理及产品活性低等实际情况，造成产量低、生产成本高、产品价格高， 影响了专业化的可操作性和市场的可接受性。
[0005] 十几年来，本发明专利申请的发明人栾兴社致力于微生物絮凝剂的研发，先后取 得了两项专利：ZL200310105515. X和ZL201210010801. 731^200310105515. X(申请人：栾兴 社；发明名称：由节杆菌制备生物絮凝剂的方法）中，申请人由土壤采样筛选了产生微生物 絮凝剂的节杆菌。筛选该菌的选择性培养基代谢针对性强，利用该菌种发酵生产微生物絮 凝剂的培养基成本低廉。但利用该筛选菌株发酵产生微生物絮凝剂的产率较低42%) 和产量也较低（< 0. 9% )。ZL201210010801. 7 (申请人：栾兴社；发明名称：一种高浓度发 酵制备生物絮凝剂的方法）中，申请人用分离的微球菌DS16通过菌量优势发酵方法进行发 酵达到了产量较高的水平（多2. 0% )。但是该方法在设备方面增加了投资，发酵工艺及操 作步骤也略显繁琐。所以，对微生物絮凝剂这一绿色的环保生物制剂来说，在现有技术基础 上进一步改善，保持高效、工艺愈加科学合理、提高产量和产率、降低生产与使用成本是产 业化和推广应用前必须攻克的技术难题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮 凝剂的方法。该菌株合成微生物絮凝剂的能力强、产率高，该制备方法所采用的发酵基质廉 价易得、发酵工艺及条件科学合理，产品活性高，应用效果好。
[0007] 本发明所提供的菌株为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.) LDX1-1，它是从山东省济南 市的南郊杏树林枯叶下的潮湿土壤中分离得到的，该菌株已于2015年9月7日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11330。该菌株可以用于制备 微生物絮凝剂。
[0008] 以上述克雷伯氏菌菌株LDXl-I制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，
[0009] (1)液体菌种培养
[0010] 将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在24-30°C、150-180r/min条 件下震荡培养l〇-18h，得液体菌种备用；
[0011] 液体菌种培养基的组分及用量为（g/L):蔗糖10-15, NH4NO3L 5-2. 5， K2HPO4O. 8-1. 3, MgSO4O. 3-0. 8, NaCl 0· 3-0. 8, FeSO40.0 1-0. 04。
[0012] (2)发酵培养（激活发酵法）
[0013] 将液体菌种按2-4% (体积比）的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中进行发酵 培养24-32h，发酵结束得发酵液，将发酵液过滤去除杂质，得液体蛋白多糖（PPS)微生物絮 凝剂。发酵液经测定，生物絮凝剂产率多60 %，产量多2. 0 %，絮凝率多94 %。
[0014] 发酵控制条件为：温度24-30°C、通气比为0. 25-0. 8VVM、搅拌转速为200-600r/ min〇
[0015] 发酵培养基的组分及用量为（g/L):蔗糖 15-30, NH4NO3L 5-4. 5, K2HPO4O. 8-2. 0， MgSO4O. 2-0. 7, NaCl 0· 2-0. 8, FeSO40.0 1-0. 04, MnSO40.0 1-0. 05,松针提取物 0· 1-0. 4,玉米 淀粉6-12,玉米浆1-3, ZnSO40.0 18-0. 040。上述培养基中的激活剂成分为：MnSOjP松针提 取物。
[0016] 该微生物絮凝剂的使用方法为：以液体状态直接混入地表水、生活污水、工业污 水、生态湖水、养殖废水、发酵培养液等中。
[0017] 将发明的微生物絮凝剂应用于对生活污水进行处理的操作方法：是往具有搅拌功 能絮凝装置的生活污水中加入适量絮凝剂，以120r/min的搅拌转速快速混合40S，然后再 以60r/min的搅拌转速缓慢混合120S。静止30min，污染物沉淀分离。吸取上清液测定。对 生活污水处理，生物絮凝剂PPS使用量（干重）为每吨水3-5g，SS絮凝率多90%，COD去除 率彡85%，重金属Mn2+去除率彡85%。
[0018] 本发明的技术效果是：本发明筛选到了一种高活性微生物絮凝剂产生菌克雷伯氏 菌LDX1-1，采用该菌株进行激活发酵法高产量生产微生物絮凝剂，具有菌株生长速度快、代 谢能力强（产率彡60% )、发酵周期短（彡32h)、产量高（彡2. 0% )、絮凝率高（彡94% ) 等优点。将本发明制备的微生物絮凝剂应用于生活污水处理，SS絮凝率多90%，COD去除 率多85%、重金属Mn2+去除率多85%等，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1菌株的筛选
[0020] (1)取样
[0021] 取济南南郊杏树林枯叶下的潮湿土壤，用无菌取样铲刮开土壤表层，取地表下 3-lOcm之间的土层放入无菌袋，并在无菌袋上标注取样日期、时间、地点、植被，将土壤菌样 尽快放入4°C冰箱保存，当天至两天内进入菌种富集筛选程序。
[0022] ⑵筛选
[0023] 将富集培养液配方中的诸成分（溶菌酶除外）配制成液体培养基，分装，每一 250mL三角瓶50mL，于121 °C高压蒸汽灭菌25min，冷却至25_28°C时，在无菌条件下加入 对应量的溶菌酶，混匀。接入采集的菌样接入培养好的富集培养液中，摇匀，于20-27Γ、 120-180r/min进行摇瓶培养至2-3天，得富集培养菌液。
[0024] 配制选择培养基，用?9cm平皿制作选择培养基平板。把富集培养菌液进行系列 稀释，选择合适的稀释度涂布选择培养基平板，20-27Γ培养2-3天，挑选生长快、粘稠度 大、有浅色圈的菌落，经纯化，然后挑选典型菌落接种于斜面培养基，培养成熟后于4°C冰箱 保存。
[0025] 各培养基如下：
[0026] 富集培养液的组分及用量（g/L):牛肉浸膏2,蛋白胨9, NaCl 5, MgSO4O. 6,溶菌酶 0· 03 (50 万 U/g)，蒸馈水 1000mL。
[0027] 选择培养基的组分及用量（g/L):丙三醇25, NaN032. 5, K2HPO4L 2, MgSO4O. 4， NaClO. 4, FeSO40.0 15, CuS042 . 0,丙酸钠 2. 0,纯化琼脂粉 15。
[0028] 斜面培养基的组分及用量（g/L):丙三醇 12, NaN032. 5, K2HPO4O. 9, MgSO4O. 6， NaCKX 6, FeSO40.0 15,纯化琼脂粉 14。
[0029] (3)菌株鉴定
[0030] 筛选菌株的个体形态特征为：长杆状L 5-L 8 μπιΧ2· 5-5. 0 μπι，短杆状 1. 5-1. 8 μ mX 1.8-2. 5 μ m。单个排列，有丰富的粘液层，不运动，没有芽孢。好氧。
[0031] 筛选菌株的培养特征为：在牛肉浸膏蛋白胨培养基平板上产生中央突起，边缘整 齐、有光泽