00g的糯米于500mL锥形瓶中，浸泡过夜后沥干，并于121°C灭菌20min， 冷却后添加 150mL无菌水，再分别加入用量为每克糯米70U、560U的α -淀粉酶和糖化酶 (即每克糯米需加入70U α -淀粉酶和560U糖化酶），于60°C酶解4h，冷却后备用。
[0022] 实施例2菌株JH301的鉴定
[0023] (1)形态学特性：
[0024] 对菌株JH301的主要形态进行考察，得到该菌株JH301的主要形态如下：菌落白 色，油脂状，表面光滑，不透明，边缘整齐；菌落直径2. 5-3. 5 μ mX 2. 5-4. 5 μ m，呈细胞圆形 或卵圆形，单生或对生，芽殖。
[0025] (2)生理生化特征：
[0026] 对菌株JH301的生理生化特征进行研究，结果见表3,由表3可知：菌株JH301可代 谢D-葡萄糖、D-半乳糖、纤维二糖、D-麦芽糖、D-蔗糖、D-棉籽糖等6种碳源，不能利用甘 油、2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、木糖醇、肌醇、山梨醇、α -甲 基-D-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、D-乳糖、海藻糖、D-松三糖等13种碳源。
[0027] 表3菌株JH301的生理生化试验结果
[0029] 注：表3中，" + "表示阳性；表示阴性。
[0030] (3)菌株JH301的26S rDNA序列测定与同源性分析
[0031] 采用TIANGEN公司的真菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株即菌株JH301 的基因组DNA。委托生物工程（上海）有限公司合成正向引物NL-I(如SEQ ID N0:1 所示）：5' -gcatatcaataagcggaggaaaag-3' ；反向引物 NL_4(如 SEQ ID NO :2 所示）： 5' -ggtccgtgtttcaagacgg-3' 〇
[0032] 以提取所获得的菌株JH301的基因组DNA为模板，且以上述引物（NL-1/NL-4)为 引物对PCR扩增其26S rDNA基因 D1/D2区域：
[0033] PCR 反应体系（50yL) :10*buffer 5.0yL、dNTP 4.0yL、NL-I 2.0yL、NL-4 2. 0 μ L、DNA 4. 0 μ L、Taq 酶 I. 0 μ L、dd H2O 32. 0 μ L ;
[0034] PCR扩增程序为：94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸 lmin，共35个循环；最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
[0035] PCR产物检测：取5 μ L的PCR产物，2 μ L的上样缓冲液，在I. 0 %的琼脂糖中凝 胶电泳分离，在EB染料上染色lOmin，用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物 进行测序，测得菌株JH301的26S rDNA序列如SEQ ID NO. 3所示。将所测得的菌株JH301 的26S rDNA序列输入Genebank以Blast软件进行序列同源性比较，并利用MEGA 5. 0软 件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，如图2所示，从而表明，该菌株 JH301与Saccharomyces cerevisiae模式株聚在最近的一个分支，序列同源性为99%以 上，Bootstrap支持率为100%，说明该菌株JH301在分子系统发育分类学上属于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌属。
[0036] 依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，最终确定菌株 JH301 属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 〇
[0037] 实施例3菌株JH301在红曲黄酒酿造中的应用
[0038] 将圆糯米浸泡过夜后蒸熟，摊开迅速冷却至30~40°C，投入盛有红曲米与水的陶 土缸中（糯米饭与红曲米、水投入重量比为I :0.04 :1. 2)，接着以5.7 X 106cfu/mL的接种 量接入经发酵培养基活化的菌株JH301，搅拌均匀；且分别以接种购自安琪酵母股份有限 公司的安琪黄酒高活性干酵母（为方便描述，将该菌株编号为AQ)、不接种任何酵母菌的酒 样（CK)为对照；然后于室温（10~15°C )温度下进行发酵，发酵1天后开始早晚各搅拌1 次，当发酵液中酒精度不再发生变化时表示发酵结束，之后进行压榨过滤制得红曲黄酒初 酿酒。
[0039] 各处理所制得的红曲黄酒初酿酒酒样主要指标检测结果见表4 :在10~15°C低 温下，添加菌株JH301强化发酵的酒样发酵速率最快，其次为添加酵母菌AQ发酵的酒样， 不添加任何酵母菌强化发酵的酒样（CK)的发酵速率最慢，三种处理的发酵周期分别为30、 35、45d。添加菌株JH301强化发酵的酒样酒精度最高，达18. 3% (v/v)，残糖含量最低，为 I. 2g/L，其次为添加酵母菌AQ酒样，其酒精度17. 6% (v/v)、残糖含量2. 4g/L，CK酒样酒 精度最低，为17. 2%，残糖含量最高，达3. 8g/L，差异均达极显著水平（P〈0. 01)，说明菌株 JH301拥有较强的酒精发酵能力；添加菌株JH301强化发酵的酒样总酸最低，为4. 56g/L，pH 值最高，达4. 11，其次为添加酵母菌AQ酒样的5. 21g/L、pH值3. 92, CK酒样的总酸最高，达 9. 56g/L，pH值最低，为3. 63,差异均达极显著水平（P〈0. 01)，说明菌株JH301产酸水平较 低，可显著降低传统红曲黄酒的发酵总酸，从而提高红曲黄酒的口感；添加菌株JH301强化 发酵的酒样尿素含量、杂醇油含量均为最低，分别为27. 23mg/L、155. 3mg/L，其次是添加酵 母菌AQ酒样，分别为56. 86mg/L、202. 4mg/L，而CK酒样的尿素含量、杂醇油含量均最高，分 别为88. 98mg/L、356. 5mg/L，差异均达极显著水平（P〈0. 01)，说明菌株JH301产尿素、杂醇 油水平较低。
[0040] 表4指标检测结果
[0042] 综上可知，本发明提供的酿酒酵母菌株JH301 (Saccharomyces cerevisiae)不仅 具有低产尿素、低产杂醇油、低产酸、高产酒精等能力、还可在l〇°C低温下进行酒精发酵，综 合发酵性能优良；利用本发明酿酒酵母菌株JH301 (Saccharomyces cerevisiae)生产红曲 黄酒，可提高红曲黄酒的的发酵品质和安全性，具有广阔的应用前景。
【主权项】
1. 一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株为酿酒酵母菌株 JH301(Saccharomycescerevisiae)，于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCN0:M2015226。
【专利摘要】本发明提供一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株JH301(Saccharomyces？cerevisiae)，该酿酒酵母菌株JH301(Saccharomyces？cerevisiae)于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO:M？2015226。该菌株JH301不仅具有低产尿素、低产杂醇油、低产酸、高耐受酒精等能力、还可在10℃低温下酒精发酵，综合发酵性能优良；利用该菌株JH301生产红曲黄酒，可提高红曲黄酒的发酵品质与安全性，具有广阔的应用前景。CCTCC NO:M201522620150412
【IPC分类】C12N1/18, C12R1/865, C12G3/02
【公开号】CN105176854
【申请号】
【发明人】何志刚, 梁璋成, 任香芸, 林晓姿, 李维新, 林晓婕
【申请人】福建省农业科学院农业工程技术研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月14日