酵液pH5.0，16-20小时后，开始以30_40Kg/h的速度流加葡萄糖，葡萄糖流加阶段，发酵液PH值保持在4.5-5.0，当菌体湿重达到80-90g/L时，停止葡萄糖流加，以.20-30Kg/h的速度流加甘油，使发酵液中菌体湿重继续上升，当菌体湿重达到120g/L以上时，停止流加甘油，当发酵罐中甘油消耗完，发酵液溶氧开始上升，菌体处于饥饿状态，饥饿培养1-2小时后，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.6%?1.0%，同时加大发酵罐通气量，保证发酵液中溶氧达到30%以上； (4)诱导产酶:甲醇流加24h后，降低发酵温度至26°C，降低发酵液pH至4.5-4.8，每隔.3小时流加发酵液体积的0.1-0.2%。的微量元素溶液，当发酵液中菌体湿重达到450-480g/L时，酶活性达到26000U/mL且不再增长，停止发酵，开始收集发酵液； (5)酶的提取:发酵液经板框过滤器过滤，上清液为木聚糖酶液，重相为单细胞甲醇蛋白菌体，上清液再次经板框过滤器过滤后，用截留分子量5000KU的超滤膜浓缩，获得木聚糖酶浓缩液，向木聚糖酶浓缩液中加入木聚糖酶浓缩液体积重量5%-10%的玉米淀粉作为载体，搅拌均匀，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥；所述的体积重量是指液体以ml计，固体以g计; (6)酶液喷雾干燥:调节喷雾干燥机进风口温度至135?155°C、出风温度至60-75°C，调节进料流量为450-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集干粉即为木聚糖酶； (7)单细胞甲醇蛋白的获得:将上述步骤(5)获得的重相收集在储液罐中，边加清水边搅拌，得悬液，悬液中菌体湿重为750-800g/L，然后送入到喷雾干燥机中喷雾干燥，调节喷雾干燥机进风口温度至145?160°C、出风温度至70-80°C，调节进料流量为400_500L/h，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白； 所述的一级种子培养基为Yro培养基，是由重量百分比计的酵母浸膏1%、胰蛋白胨2%、葡萄糖2%和余量的水混合在一起组成； 所述的无机盐培养基是由磷酸12.6g、二水硫酸钙0.18g、硫酸钾4.4g、硫酸亚铁.0.38g，七水硫酸镁7.12g、氢氧化钾1.45g和甘油40g加水至IL制成，用氨水调pH值至.4.8-5.0 ； 所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜2.2g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4.5g，二水钼酸钠0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.1g,氯化锌8g，七水合硫酸亚铁32g，质量浓度98%的浓硫酸3mL和生物素0.2g加水至IL制成。3.根据权利要求1所述的一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下: (1)一级种子的培养:一级种子培养基采用YB)培养基，用2000mL三角瓶分装，每瓶装液量为500mL，瓶口用8层纱布包裹，121°C灭菌30min后冷却备用，取3_5支试管斜面保藏的菌株hgd-xm-301，用接种环刮下并接入至有500mL —级种子培养基的三角瓶中，每支试管斜面接种两瓶，接种后在30°C摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子； (2)二级种子的培养:二级种子培养基采用无机盐培养基，121°C灭菌30min后冷却，再在每升无机盐培养基中加入4mL经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液，得培养液，先在发酵罐中放入60L培养液，进行实罐灭菌，冷却后用磷酸或氨水调整培养液pH值到.4.8-5.0，取样镜检一级摇瓶种子生长情况，将个体较大，发芽2-3个，无杂菌感染的一级摇瓶种子3-4L接入到发酵罐中的培养液上，在30°C，pH4.8-5.0，通气量0.5-1.2ν/ν.πι，搅拌转速400-650rpm，培养时间20_26h，得二级种子； (3)高密度发酵:在5m3发酵罐装1.5m3的发酵培养基和200mL聚醚改性硅消泡剂，打开发酵罐上的盘管的进出口蒸汽阀门，使蒸汽进入盘管并对发酵培养基加热，待温度升至.80°C时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐的底部放料口、空气进口、取样口进入到发酵罐内，使发酵培养基温度上升至121-123°C，保持罐压1.l_1.4MPa，灭菌30min，同时，用蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基冷却后，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素溶液60L，并用氨水调节pH至4.8-5.0 ; 将上述培养好的二级种子60L接入到上述5m3发酵罐中的发酵培养基上进行培养，在.30°C，通气量为0.4?0.5v/v.m，搅拌转速为60_80rpm的条件下开始培养，每隔4小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L以上后，通气量加大至1.0?1.5v/v.m，提高搅拌转速到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20小时后，发酵培养基中甘油消耗完，溶氧开始上升，此时，开始以30-40Kg/h的速度流加葡萄糖，在葡萄糖流加阶段，发酵液pH保持在4.5-5.0，当发酵液中菌体湿重达到80-90g/L时，停止葡萄糖流加，以20_30Kg/h的速度流加甘油，使发酵液中菌体湿重继续上升，当菌体湿重达到120g/L以上时，停止流加甘油，当发酵罐中甘油消耗完后，发酵液溶氧开始上升，菌体处于饥饿状态，饥饿培养1-2小时后，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.6%?1.0%，同时加大通气量，保证发酵液中溶氧达到30%以上； (4)诱导产酶:甲醇流加24小时后，发酵液中菌体湿重达140-150g/L，酵母细胞内开始形成酶蛋白，此时，开始进行诱导木聚糖酶生产，即降低发酵温度至26°C，调整发酵液pH至.4.5-4.8，每隔3小时流加发酵液体积0.1-0.2%。的微量元素溶液，诱导产酶80-100小时后，发酵液中菌体湿重达到450-480g/L，酶活性达到26000U/mL，随后每隔2小时取样测定酶活性，当酶活性比前一次酶活性增长量低于5%时，即为不再增长，收集发酵液； (5)酶的提取:发酵液经板框过滤器将单细胞甲醇蛋白与木聚糖酶分离，方法是，发酵液经板框过滤器过滤，上清液为木聚糖酶液，重相为单细胞甲醇蛋白菌体，上清液再经板框过滤器过滤后，用截留分子量5000KU的超滤膜浓缩，获得木聚糖酶浓缩液，向木聚糖酶浓缩液中加入木聚糖酶浓缩液体积重量5%-10%的玉米淀粉作为载体，搅拌均匀，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥； (6)酶液喷雾干燥:调节喷雾干燥机进风口温度至135?155°C、出风温度至60-75°C，调节进料流量为450-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集干粉即为木聚糖酶； (7)单细胞甲醇蛋白的获得:将上述步骤(5)获得的重相收集在2m3储液罐中，边加清水边搅拌，得悬液，悬液中菌体为750-800g/L，然后送入到喷雾干燥机中喷雾干燥，调节喷雾干燥机进风口温度至145?160°C、出风温度至70-80°C，调节进料流量为400_500L/h，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。
【专利摘要】本发明涉及一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用，有效解决现有甲醇蛋白生产中存在的产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低的难题，一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母，分类命名为巴斯德毕赤酵母hgd-xm-301菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO.？M2013519，保藏日期为：2013年10月30日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，本发明实现了木聚糖酶与甲醇蛋白的共发酵生产，使装置多用，降低生产成本，提高生产效益，简化生产工艺，降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染。CCTCC NO. M201351920131030
【IPC分类】C12R1/84, C12N1/16, C12N9/42
【公开号】CN105176853
【申请号】
【发明人】苟万晓, 范延超, 王乐, 石自更, 胡元森, 卫红伟, 任晓辉, 吕扬勇, 白冠章, 侯龙龙, 买旭林, 段兴志, 张瑛乐, 习旭艳, 张荣静
【申请人】义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月16日