mM pH 5. 2Mcllvaine缓冲液：51. 5ml的0· 2M似2册04与 48. 5ml的0.1 M柠檬酸混匀得到的。
[0043] 下述实施例中的0.1 M碳酸钠溶液的制备方法：准确称取10. 599g无水碳酸钠，用 蒸馏水溶解，定容至I〇〇〇mL。
[0044] 下述实施例中的（pNP)标准溶液的制备方法：将IOmg pNP (对硝基酚）用0.1 M碳 酸钠溶液溶解并定容成I mg/mL的标准母液，然后稀释成0、25、50、75、100、125、150、175、 200、225、250mg/ml的pNP标准溶液，以制作标准曲线。
[0045] 下述实施例中的质粒pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl为在pBluescript SK(+)载体上插入 cbhl基因的启动子Pcbhl、信号肽sig和终止子Tcbhl后得到的载体；其中，pBluescript SK(+)购买自Stratagene公司，产品目录号为VKS0288。
[0046] 实施例1、高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备
[0047] -、高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备
[0048] 1、扬奇青霉α -半乳糖苷酶表达载体的构建
[0049] (1)扬奇青霉α -半乳糖苷酶基因的扩增
[0050] 以含有扬奇青霉α -半乳糖苷酶基因全序列质粒为模板，采用Pagl-F和Pagl-R 引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，为序列表中序列1所示的DNA分子，即为不含信号 肽的扬奇青霉α-半乳糖苷酶基因片段。引物序列如下（下划线代表酶切为点）：Pagl-F: 5'-GGAATTCCAGGACTCAAACGCAAACCCAATCGTG-3' ：Pagl-R :5'-GACTAGTCTAATGATGATGATGATGA TGCTGCCTCTCCAACATCACAA-3'。
[0051] 上述PCR扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸 lmin，30个循环，最后72°C扩展延伸lOmin。
[0052] (2)扬奇青霉α -半乳糖苷酶表达载体pSK-Pagl-Histag的构建
[0053] 用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切质粒pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl，回收大小为 7. Ikb的骨架载体，用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切上述步骤（1)获得的PCR扩增产 物，回收大小为2. 2kb的DNA片段，连接大小为7. Ikb的骨架载体和大小为2. 2kb的DNA片 段，得到pSK-Pagl-Histag重组载体。并对其进行测序验证。
[0054] 测序结果表明：pSK-Pagl-Histag重组载体为将序列表中序列1所示的DNA分子插 入 pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl 载体的 EcoRI 和 SpeI 酶切位点间，且保持 pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl 载体的其他序列不变得到的载体。pSK-Pagl-Histag重组载体表达扬奇青霉α-半乳糖苷 酶，扬奇青霉α-半乳糖苷酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
[0055] (3)含筛选基因质粒pSK_pyr4的构建
[0056] 以里氏木霉基因组为模板，采用Fpyr4和Rpyr4引物进行PCR扩增，得到大小约 为2.9kb的pyr4表达盒，pyr4表达盒的核苷酸序列如序列表中序列2所示。引物序列 如下：Fpyr4 : AAGCTT GACTAGACTGACCCCCCCG(下划线为 Hind III 酶切位点）；Rpyr4 : ATCGA r CAACTGCATCCAAACCATCCTACC (下划线为 Cla I 酶切位点）。
[0057] 用限制性内切酶Hind III和Cla I双酶切pBluescript SK(+)载体，回收大小 为3. Okb的骨架载体，用限制性内切酶Hind III和Cla I双酶切上述pyr4表达盒，回收大 小为2. 9kb的DNA片段，连接大小为3. Okb的骨架载体和大小为2. 9kb的DNA片段，得到 pSK-pyr4载体。并对其进行测序验证。
[0058] 测序结果表明：pSK_pyr4载体为将序列表中序列2所不的DNA分子插入 pBluescript SK(+)载体的 Hind III 和 Cla I 酶切位点间，且保持 pBluescript SK(+)载 体的其他序列不变得到的载体。
[0059] 2、里氏木霉原生质体制备
[0060] (1)取培养在平板（马铃薯200g ;葡萄糖20g ;琼脂粉20g ;自来水定容至1L，自然 pH，115°C高压蒸汽灭菌）上新鲜的里氏木霉Tu6 Λ tku70菌株的孢子，用适量无菌水洗涤 孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种到装有IOOmL MM培养基的三角瓶中，28°C培养14h，至菌丝伸展，得到培养液；
[0061] (2)将步骤（1)获得的培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最 后用I. 2M的硫酸镁洗涤一次，让溶液自然流尽，得到洗涤后的菌体；
[0062] (3)将洗涤后的菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中（裂解液是含有150mg的 lysing enzyme和15mg cellulose的I. 2M硫酸镁）30°C反应I. 5h，显微镜下观察原生质体 产生的情况，Ih后每隔IOmin取样观察一次；
[0063] (4)当原生质体大量产生并仍有大量菌丝存在时，加等体积0. 6M的山梨醇溶液终 止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集原生质体沉淀；
[0064] (5)沿着沉淀一侧倒去上清，用1.0 M山梨醇溶液重悬上述步骤（4)获得的原生质 体沉淀，室温3000rpm离心10min ;
[0065] (6)重复步骤（5)，弃上清，将原生质体悬浮于200微升1.0 M山梨醇溶液中，血球 板计数器观察并计数，得到里氏木霉原生质体。
[0066] 3、转化
[0067] (1)用限制性内切酶Ase I对上述步骤1获得的pSK-Pagl-Histag重组载体线性 化，得到线性化的pSK-Pagl-Histag。在反应体系中加入1/10体积的3M醋酸钠 （pH 5. 2) 充分混匀，再加入2. 5倍体积无水乙醇充分混匀后置于-20°C条件下反应30分钟，4°C、 12000rpm离心15分钟，弃上清，留白色沉淀，用70%乙醇洗两次，再用CldH2O溶解，使线性 化片段的浓度达到微克级；
[0068] (2)将上述步骤1获得的pSK_pyr4载体及线性化的pSK-Pagl-Histag按摩 尔比1:4的比例（总体积不超过20 μ 1)加入到上述步骤2制备的里氏木霉原生质体 中，轻轻混匀，加入50 μ 1 50 % PEG 4000混匀，冰浴30分钟，并以CldH2O代替线性化的 pSK-Pagl-Histag 作为对照；
[0069] (3)向步骤⑵的产物中加入1ml 50% PEG 4000混匀室温放置20分钟；
[0070] (4)在步骤⑶的产物中加入1ml IM山梨醇，混匀后分装4支EP管，与冷却的含 IM山梨醇的MM培养基混匀后铺于MM加 IM山梨醇的底层培养基上；
[0071] (5)将上述平板放于30°C恒温培养箱培养4-7天。
[0072] 4、里氏木霉α -半乳糖苷酶表达菌株转化子的筛选及分子鉴定
[0073] 待转化子长出后，将其置于PDA平板上，30°C培养7天，孢子成熟后，用无菌水将孢 子洗出制成孢子悬液，进行梯度稀释，涂布于含有〇. 1% Triton XlOO的MM培养基上培养。 待长出菌丝后，抽提基因组DNA，进行PCR鉴定，得到高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木 霉菌株，PCR鉴定的引物序列如表2所示。
[0074] 里氏木霉α -半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的鉴定结果如图1所示：从图中可 以看出：α -半乳糖苷酶基因已成功转化到里氏木霉基因中，且定点整合到cbhl基因位置。
[0075] 表2、里氏木霉α -半乳糖苷酶表达菌株转化子分子鉴定所用引物
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[0077] 二、高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株发酵生产α -半乳糖苷酶
[0078] 1、发酵
[0079] 将上述步骤一中的4获得的高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株加入 到30ml的玉米浆工业发酵培养基（玉米芯I. 5g ;麸皮0· 9g ;玉米浆L 5% (体积分数）； 加30ml/瓶，调pH 4. 8,121°C高压蒸汽灭菌）中，使终浓度为IO5个孢子/ml发酵液，并以 Λ tku70菌株作为对照菌株，30°C，200rpm发酵7天，离心收集发酵液，通过SDS-PAGE及质 谱鉴定，得到目的蛋白α-半乳糖苷酶。
[0080] SDS-PAGE鉴定结果如图2所示：1为对照菌株Λ tku7