0 μ L，6复孔，置5% C02, 37°C培养箱培养48小时。终 止培养前4h每孔加入5mg/mL的MTT20 μ L，混匀后继续培养。培养结束后，轻轻吸弃上清 液，每孔加150 μ L的DMS0,振荡IOmin使紫色结晶完全溶解，酶标仪测定570nm波长处的吸 光度。增殖率计算：
[0122] 增殖率（％ )=(受试孔OD值一对照孔OD值）/对照孔OD值X 100 % (公式 6) 〇
[0123] 2、实验结果
[0124] 不同浓度药性菌质多糖对脾淋巴细胞增殖的影响见表1
[0125] 表-1不同浓度药性菌质多糖对淋巴细胞的增殖作用（0D值，；± ^ )
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[0128] 注：与空白组比较，*P〈0. 01。
[0129] MTT法检测药性菌质多糖对淋巴细胞增殖作用的影响结果如表1，与空白组比较， ConA和LPS处理的淋巴细胞增殖作用极其显著，JZPC、JZPJ、JZP3试验的4个浓度均能 促进淋巴细胞增殖（P〈〇. 01)，JZPl和JZP2随浓度增大，对脾淋巴细胞增殖率逐渐减小， 在1000 μ g/mL浓度时，对淋巴细胞增殖起抑制作用（p〈0. 01)，抑制率分别为15.66%、 13. 25%〇
[0130] 实验结果表明本发明获得的药性菌质有较好的免疫调节作用。
[0131] 五、药性菌质的急性毒性：
[0132] 1、实验材料：
[0133] 药性菌质粗多糖：由一、（一）（药性菌质活性部位的提取方法）获得的药性菌质 粗多糖。
[0134] 实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18_22g，南昌大学医学部实验动物中心提 供。购入后正常饮食及饮水适应环境3-5d，饲养环境室温20-25Γ，并观察除去不合格动 物。
[0135] 2、实验方法：
[0136] 根据Horn法进行预实验，昆明小鼠随机分为3组，每组2只，试验采用灌胃剂量 分别为0.1 、1. 0、10.0 g/kgBW。对各组小鼠采用相应剂量都只进行一次灌胃，灌胃后24h内 密切观察小鼠出现的症状及死亡数，估计大致的最小100%致死量（Dm)和最大0致死量 (Dn) 〇
[0137] 若预实验能得到Dm和Dn，则按寇氏法进行LD5。的测定。将Dm和Dn换算为常用 的对数，然后将最高和最低剂量的对数之差，等距分成5个对数，设5个剂量组，每组10只 动物，雌雄各半，依次称重，记录体重并染号。实验前小鼠禁食不禁水12h，小鼠灌胃容量每 次0. 2mLl/10g。给药后连续观察lh，然后于2、4、6、8、12、24h分别观察1次，以后每天上下 午同一时间观察1次，连续观察14d并做好观察记录，并于第7d和第14d同一时间称量体 重，并记录体重。观察记录指标包括小鼠的活动情况、体型外观，精神状态，采食，被毛，对 外反应、异常分泌物、大小便颜色及形状，呼吸等毒性反应及死亡情况，若有死亡，就立即解 剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、大小肠、脑等主要脏器质地色泽变化情况。发现有病变的 器官应做病理组织学检查。按下列公式计算LD50及标准误、95 %可信限。
[0138] LogLD50 = XK-d ( Σ ρ-0· 5)(公式 7)，
[0139] LD50 的标准误（S): CN 105176844 A 说明书 11/12 页
[0141] LD50的95%可信限⑴：
[0142] X = log 1GogLDSO ±1.96 X SlogLD5。）（公式 9)
[0143] 若预实验无法测出Dm，则进行最大耐受量试验。
[0144] 动物分组：雄雌性小鼠各10只，依次称重，记录体重，并染号。
[0145] 试验开始前小鼠禁食不禁水16小时，根据受试物最大溶解度和最大灌胃容积 (20mL/kgBW)给予小鼠灌胃。所有小鼠24h内灌胃次数不能超过3次，间隔时间4-6h。给 药后2h提供食物，并连续观察lh，于2、4、6、8、12、24h分别观察1次，以后每天上下午同一 时间至少各1次，连续观察14d做好观察记录，并于第7d和第14d同一时间称量体重，并做 好记录。观察指标包括小鼠的活动、体型外观，精神状态，采食，被毛，对外反应、异常分泌 物、大小便颜色及形状，呼吸等毒性反应及死亡情况，若有死亡，立即解剖，肉眼观察心、肝、 脾、肺、肾、胃、大小肠、脑等主要脏器的外观变化。连续观察14d并记录动物中毒表现及特 点，毒性反应出现、毒性反应消失时间及动物死亡时间，观察期结束后将每组存活的小鼠处 死并解剖，检查小鼠心脏、肺部、肝脏、胸腺、肾脏、脑组织、胃部及肠道等器官的色泽、位置 及质地等，肉眼观察各脏器有无异常，如有肉眼可见的病变，进行组织病理学检查。
[0146] 3、实验结果：
[0147] 桦褐孔菌菌质多糖经灌胃给予小鼠后观察，小鼠行为动作与对照组无差异。给药 后第1天观察，小鼠行为活动与对照组没有显著区别，对刺激反应迅速，眼睛、鼻孔未见分 泌物，但粪便粘度较大，颜色较平时偏深，可能产生含多糖类便。给药后第2天观察，小鼠的 行为活动等其他观察项目与对照组无异，小鼠饮食正常。给药第3天观察，小鼠行为活动与 对照小鼠无异，眼睛鼻子也未见分泌物，观察到其粪便颜色和粘度均和对照组相同。从给药 后第4天直到第14天，即到实验观察结束时，小鼠的各项观察指标均与正常对照组无异，小 鼠无一例死亡。实验观察结束时，小鼠脱白处死进行大体解剖，与对照组对比仔细观察各脏 器颜色质地等内容，均未发现异常情况。累计小鼠灌胃剂量，实验小鼠对药性菌质多糖最大 耐受剂量大于21g/kg。其体重变化与死亡情况见表2。
[0148] 表2-急性毒性试验小鼠体重变化及死亡情况（&士S )
[0150] 实验结果表明本发明获得的药性菌质毒性极小或无毒性。
[0151] 本发明将桦褐孔菌接种在中药材或中药渣药性基质上进行双向固体发酵，生产的 药性菌质无毒性，具有良好的抗氧化作用、降糖作用和免疫调节等作用，有效解决了珍稀药 用真菌-桦褐孔菌的资源短缺问题，并为中药渣的有效再利用开辟了新途径。
[0152] 上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方 式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下 作出各种变化。
【主权项】
1. 一种桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征在于，具体步骤包括： 发酵基质的准备，即对药性基质的处理；发酵菌种桦褐孔菌的处理；将桦褐孔菌接种于药 性基质上；进行双向固体发酵；收集药性菌质。2. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征 在于，所述药性基质在处理时，对药性基质进行粉碎，加入水使其含水量为50-65%，装瓶并 121C尚压灭困lh。3. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特 征在于，所述发酵菌种的处理方法是将桦褐孔菌进行活化后，并于28°C条件下扩增培养 14-16d，扩增培养的方法是采用液体培养基摇瓶培养。4. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征在 于，所述双向固体发酵的发酵条件为温度范围26°C-28°C，发酵天数为40-60d。5. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征在 于，所述药性基质是指中药材或中药渣。6. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征在 于，所述中药材或中药渣为葛根、葛根芩连汤组方药材、六味地黄丸组方药材、葛根药渣、葛 根芩连汤药渣或六味地黄丸药渣。7. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，其特征在 于，所述药性菌质是桦褐孔菌在含有中药材或中药渣的药性基质上经固体发酵而产生的菌 质。
【专利摘要】本发明公开了一种桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法，具体步骤包括：发酵基质的准备，即对药性基质的处理；发酵菌种桦褐孔菌的处理；将桦褐孔菌接种于药性基质上；在一定条件下进行双向固体发酵；收集药性菌质，所述药性基质在处理时，对药性基质进行粉碎，加适量水，装瓶后高压灭菌，所述发酵菌种的处理方法是将桦褐孔菌进行活化并于28℃下扩增培养14-16d，扩增培养的方法是采用液体培养基摇瓶培养。本发明将桦褐孔菌接种在中药材或中药渣药性基质上进行双向固体发酵，生产的药性菌质无毒性，具有良好的抗氧化作用、降糖作用和免疫调节等作用，有效解决了珍稀药用真菌-桦褐孔菌的资源短缺问题，并为中药渣的有效再利用开辟了新途径。
【IPC分类】A61P39/06, A61P3/10, A61P37/02, C12N1/14, A61K36/07
【公开号】CN105176844
【申请号】
【发明人】谢小梅, 梁永红, 李东文, 苏明声, 王平, 谢小琴
【申请人】江西中医药大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月27日