，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75%的酒精消毒2min ; 再用无菌水冲洗2次，0. 1 %的升汞浸泡2min，最后用无菌水冲洗3次。将最后一次冲洗用 的无菌水，分别汲取3次，按每次0. 5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28°C 黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
[0044] ③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶 片剪成小片，每片约〇. 5X0. 5cm2,用接种针挑至PDA培养基接种培养，每只培养皿接8片。 置于恒温培养箱中28°C黑暗条件下培养5-14天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
[0045] (2)本发明培养方法
[0046] ①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
[0047] ②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用 流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75%的酒精消毒2min ; 再用无菌水冲洗2次，0. 1 %的升汞浸泡2min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用 的无菌水，分别汲取3次，按每次0. 5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28°C 黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
[0048] ③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶 片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙（尺度为过100目筛同时被200目筛截留），加入无菌 7K，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2 ;共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无 菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后， 置于恒温培养箱中28°C黑暗条件下培养3天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。其试验结 果如下：
[0049] 表3:叶片质量对比
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[0051] 表4 :分离得到的菌株数量对比
[0053] 表5:培养周期对比
[0055] 表6 :使用的培养培养皿数
[0057] 上述试验表明：
[0058] ①同一植株，相邻部位，质量相近，有一定的可比性；
[0059] ②分离菌株数量方面，本发明方法是组织切片法的1. 65倍，说明采用完整叶片， 比部分叶片获得的组织更完整，本发明方法更有利于内生真菌菌株的生长；
[0060] ③在使用培养培养皿的数量上，组织切片法是本发明方法使用数量的2. 5倍，在 节约成本方面本发明方法有优势；
[0061] ④培养周期方面，本发明方法比组织切片法用时短，分析原因应该是本发明方法 中组织破碎颗粒度小、均匀，有利于缩短菌株生长周期中的调整期。
[0062] 综合试验结果，本发明方法优于组织切片培养分离，在艾纳香植物叶片内生真菌 分离方法中是一种优良的方法。
【附图说明】
[0063] 图1 :本发明培养图
[0064] 图2 :组织切片培养图
【具体实施方式】
[0065] 以下实施方式旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。
[0066] 实施例1 :本发明培养方法
[0067] ①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
[0068] ②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用 流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75%的酒精消毒2min ; 再用无菌水冲洗2次，0. 1 %的升汞浸泡2min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用 的无菌水，分别汲取3次，按每次0. 5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28°C 黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
[0069] ③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶 片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙（尺度为过100目筛同时被200目筛截留），加入无菌 7K，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2 ;共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无 菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后， 置于恒温培养箱中28°C黑暗条件下培养3天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
[0070] 实施例2 :本发明培养方法
[0071] ①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
[0072] ②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用 流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75%的酒精消毒3min ; 再用无菌水冲洗2次，0. 1 %的升汞浸泡3min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用 的无菌水，分别汲取3次，按每次0. 5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28°C 黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
[0073] ③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶 片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙（尺度为过100目筛同时被200目筛截留），加入无菌 7K，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2 ;共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无 菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后， 置于恒温培养箱中28°C黑暗条件下培养10天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
【主权项】
1. 一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片； (2) 艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用 流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内；然后无菌水冲洗2-3次，用75%的酒精消毒 2-3min;再用无菌水冲洗2-3次，0. 1 %的升萊浸泡2-3min，最后用无菌水冲洗3次；将最后 一次冲洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0. 5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培 养箱内，28°C黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长； (3) 艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，剪去叶柄，再将叶片剪成小 片，放入研钵，混入灭菌细沙，加入无菌水，共同研磨至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和 无菌水的混合物；用接种针挑取混合物至培养基接种后，置于恒温培养箱中培养3-10天， 进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。2. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（1)中叶片的采集是从叶柄与茎连接处剪下，并用保鲜膜封缠剪切面。3. 根据权利要求1所述的艾纳香植物叶片内生真菌的一种分离方法，其特征在于：步 骤（1)中叶片的保存是将采集的样品平整、无折皱、无挤压放入自封口袋中，4°C保存。4. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（1)中健康叶片是指完整叶片，无虫咬、无机械损伤和无菌斑。5. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（2)中叶片组织的表面消毒为采用75%的酒精消毒2min，0. 1%的升汞浸泡2min。6. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（2)中流动清洁水冲洗是采用水流方向与叶面平行与地面垂直的垂直平行冲洗方式，出 水口距离冲洗点高度15cm，冲洗流量为2L/min，冲洗面积为50cm2，冲洗时间为5min。7. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（3)中研磨使用"尺度限制性沙磨"技术：所用叶片大小为0.5X0. 5cm2，灭菌细沙颗粒大 小为通过100目筛同时200目筛截留的细沙，叶片、细沙和无菌水的比例为1:3:2,混合物采 用人力手工研磨。8. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于： 步骤（3)中真菌培养使用"约束性散接培养"技术：挑取植物组织、细沙和水混合物体积 0. 5X0. 5X0. 2cm3;接种面积Icm2;混合物在约束面积内均匀铺开。9. 根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步 骤（3)中真菌培养使用PDA培养基。10. 根据权利要求1-9任一项所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特 征在于：采用艾纳香植物整叶片进行内生真菌培养的分离方法。
【专利摘要】本发明提供了一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,提出“单叶内生真菌分布”概念，“尺度限制性沙磨”和“约束性散接培养”两种技术方法，以期完善艾纳香植物叶片内生真菌对植物叶片的生理生化和代谢产物产生怎样影响的研究，改善和解决现有方法中存在的某些菌种丢失的缺陷和培养过程中真菌生长相互干扰等问题。本发明提供的艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,操作简单快捷,试验材料简单易得，成本较低。
【IPC分类】C12N1/14
【公开号】CN105176841
【申请号】
【发明人】唐青, 康冀川, 黄英, 王鲁, 雷帮星, 钱一鑫, 唐丽
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月13日