一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其筛选和鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物杀虫剂技术领域，尤其是一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及 其筛选和鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 白僵菌（Beauveria bassiana)是当前世界上研究和应用最广泛的一种虫生真菌 之一，它具有致病力强、寄主范围广、不污染环境、使用方便、不伤害天敌、能持续控制害虫 等特点。白僵菌目前已经被广泛应用于农林害虫的防治，可用于防治蛴螬、家蝇、介壳虫、白 粉虱、蚜虫、蓟马、马铃薯叶甲、蜚蠊、蝗虫、蚱蜢、蟋蟀、棉铃象、棉跳盲蝽、玉米螟、天牛、甘 蔗金龟子等害虫。多年来，国内应用白僵菌对40余种农林害虫的防治已经取得成功，如今 在生产中使用的主要有：松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、茶小绿 叶蝉、桃小食心虫等。依据形态指标、生理生化指标及核酸指标将白僵菌属分为7个种，分 别是球孢白僵菌、布氏白僵菌、白色白僵菌、多形白僵菌、蠕孢白僵菌、粘孢白僵菌和苏格兰 白僵菌，其中最为常见和应用最广泛的是球孢白僵菌。
[0003] 桉蝙蛾是近年来危害南方主要人工林树种桉树的主要蛀干害虫，该虫主要危害桉 树主干，侧枝也有危害，轻则影响木材的生长，重则主干断裂导致死亡。目前为止，关于该虫 的防治主要集中在化学农药的防治，化学农药的使用虽然见效快，但破坏了土壤结构，造成 土壤污染不利于作物生长，长期使用使病虫有抗逆性从而影响了防治效果，而且给环境造 成不良的影响。生物防治具有对环境友好且有持续控制害虫的作用，白僵菌作为生物防治 的主要手段之一已被广泛应用用于数多种害虫的防治。据研究报道，白僵菌对桉蝙蛾的寄 生率很高，有望成为控制该虫的生物防治手段。因此，研究桉蝙蛾高毒力白僵菌的筛选及鉴 定等基础研究工作，对利用生物防治手段持续该虫意义重大，为蛀干害虫的防治提供了新 的思路。
【发明内容】
[0004] 本发明是通过从感染白僵菌的桉蝙蛾幼虫上分离纯化获得球孢白僵菌，经过和其 他5株来源于桉蝙蛾的白僵菌在同等条件对桉蝙蛾的毒力测定，筛选出1株高毒力的B-36 球孢白僵菌菌株，具有很大的开发应用价值。
[0005] 本发明的目的是提供一株新的球孢白僵菌（(Beauveriabassiana (Balsamo) Vuillemin)，代号为 B-36。
[0006] 本发明的另一目的是提供B-36球孢白僵菌的培养、筛选及鉴定方法。
[0007] 为了实现以上目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明公开的球孢白僵菌菌株，代号B-36,于2015年7月7日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 11057,保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009] 本发明公开的B-36球孢白僵菌菌株的形态学特征和核糖体DNA-ITS测序如下：
[0010] 形态特征：菌丝细长，菌丝宽度为1-3 μ m，透明无色，分支，有横隔膜，分生孢子梗 为瓶状，由分支的菌丝长出分生孢子梗，分生孢子梗成直角分支，排列成"Z"字形或螺旋状， 梗上长出圆柱形或瓶装的产孢结构，分生孢子产于产孢结构的顶端，分生孢子球形或椭圆 形，分生孢子大小长为2. 20-2. 93 μ m，宽为1. 62-2. 03 μ m。
[0011] DNA-ITS测试结果：B-36球孢白僵菌菌株特异性核糖体DNA-ITS序列碱基数 535bp，具体的氨基酸顺序为：
[0012] tgattcgagg tcacgttcag aagttgggtg ttttacggcg tggccgcgtc ggggttccgg 60 tgcgagctgt atttactacg CagaggtcgG cgcggacggg: ccgGcactcc atttcagggc 110 Cggeggtgtg etgccggtec ccaacgcega cctccccaag gggaggtega gggttgaaat 180 gacgctcgaa caggcatgcc cgccagaatg ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc 240 gatgattcac tggattctgc aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg 300 atgccagagc caagagatcc gttgttgaaa gttttgattc atttgttttg ccttgcggcg .360 tattGagaag atgctggaat： acaagagttt gaggtcceeg gegggccgct ggtceagtcc 420 gcftecgggc tggggegagt ccgccgaagc aaGgataggt aggttcacag aagggttggg 4：B0 gagttgaaaa c：tGggtaatg atccctccgc tggttcacca acggagacct tgttc 5.:3:5 〇
[0013] 高毒力B-36球孢白僵菌菌株的筛选方法
[0014] 从感染白僵菌的桉蝙蛾幼虫分离获得，采用常规的组织分离法分离和单孢分离法 获得6株白僵菌菌株，具体如表1所示，分离后采用SDAY培养基在温度为25 °C，湿度为95 % 培养8-12天，用钩针钩取一定量的孢子粉放入装有0. 1 %吐温的20mL无菌水中充分混匀， 逐步稀释至1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍，得到不同稀释倍数的菌液，由于浓度 太高无法挑取单菌落，取上述后三个浓度的菌液50-100 μ L分别涂布于SDAY培养基平板， 在温度为25-26 °C，湿度为80-90 %，pH值为6. 0-7. 0的培养箱培养，培养3-4天的过程中， 待长出单个白色的菌落后，挑取单菌落转至另一个SDAY培养基平板上培养，培养过程中未 发现有青霉等杂菌污染时，即可转移至SDAY试管培养基，培养2周后有大量分生孢子长出， 即可得到白僵菌分生孢子粉，即可将试管贴好标签后转入4°C冰箱冷藏保存，保存半年左右 后转管培养后继续保存。
[0015] 将6株白僵菌菌株培养得到的分生孢子粉，用含有0. 1%吐温-80的无菌水将将孢 子洗下，调整孢子悬浮液的浓度为LOXlO7个/mL，将桉蝙蛾幼虫侵入孢子悬浮液中5s后 拿出吸干虫体表面的水分，放入铺有湿润滤纸的玻璃瓶中，盖好瓶盖放入25°C，90 %湿度条 件下培养，每处理3个重复，每个重复12头幼虫，以侵入无菌水的处理为对照。逐日观察桉 蝙蛾的死亡情况，统计死亡率，并计算致死中时LT5。值。
[0016] 以各菌株的死亡率对应的几率值为纵坐标，以培养天数的对数值为横坐标，做线 性回归方程，根据死亡率计算LT5。值，LT5。值越小毒力越大，从中筛选出高毒力的B-36球孢 白僵菌。
[0017] 上述SDAY培养基的制备方法：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、琼脂粉15-20g 和水1L，PH值自然。制备过程：取上述称好的葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母粉IOg加入IL 水中，搅拌至溶解，在将琼脂粉加入上述溶液边搅拌边加热，待琼脂粉溶解后分装至250ml 三角瓶内，〇· IMPa压力下，121°C灭菌20-25min。
[0018] B-36球孢白僵菌的鉴定方法
[0019] 将B-36球孢白僵菌于SDAY液体培养2周后，纱布过滤，收集菌丝至底部垫滤纸的 灭菌的培养皿上，自然风干后放冰箱冷藏备用。将上述干菌丝放入灭菌研钵中，加入液氮充 分研磨，采用北京康为世纪生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，步骤如 下：
[0020] a.将研磨菌丝装入I. 5ml离心管，加入700 μ L65°C预热的Buffer GP1,迅速颠倒 混匀后，将离心管置于65°C水浴20min，期间颠倒离心管数次。
[0021] b.接入700 μ L氯仿，充分混匀，12 OOOrpm离心5min。
[0022] c.将上清液转入一新的离心管，加入700 μ L GP2,充分混匀。
[0023] d.将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置3min，若以 此不能加完溶液，可分多次转入，10 OOOrpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集 管中。
[0024] e.向吸附柱中加入500 yL Buffer GW1，10 OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0025] f.向吸附柱中加入500 yL Buffer GW2,10 OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0026] g. 12 OOOrpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温4min，以彻底晾 干。
[0027] h.将吸附柱置于一个新的