在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法
【专利说明】在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其 鉴定方法
[0001] 本申请是2003年5月21日提交的同名发明专利申请03814626. 6、 201010575786. 1 及 20141003195. 3 的分案申请。 【发明领域】
[0002] 本发明涉及蛋白质化学、分子生物学以及免疫学。
[0003] 【相关技术领域背景】
[0004] 抗体能以高度的特异性和亲和力识别并靶向几乎任何分子。这个特点已被开 发，以便将这些天然蛋白转变为用于诊断和治疗应用的强有力的工具。重组DNA技术的 进展已推动了抗体基因在广泛种类的非淋巴细胞中的操作、克隆和表达（Skerra，1988; Martineau, 1998 ;Verma, 1998)。已经构建了许多不同的抗体片段，以便最佳地满足各种 应用。保留整个母体免疫球蛋白全部抗原结合能力的最小实体是单链Fv片段（scFv) (Bird，1988)。该抗体片段包含由柔性肽接头连接起来的重链和轻链可变区，这使得该蛋白 能够由单个基因表达。
[0005] 抗体片段较之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的优势。由于分子 小，它们在多种表达宿主细胞如大肠杆菌细胞中的表达得以易化、且产量得以提高 (PlUckthun，1996)。而且，抗体片段允许在体内应用中改善肿瘤穿透力（Yokota，1992)，并 且它们能够与多种用于治疗途径的效应分子共价连接。
[0006] 天然存在的抗体是由浆细胞分泌的，已进化至能够在胞外氧化环境中行使功能。 为获得其功能性折叠结构，它们通常需要在不同结构域内形成二硫键，这对于免疫球蛋白 折叠是至关重要的。与全长抗体形成对照，scFv或Fab抗体片段原则上能够在任何细胞 内部的还原环境中功能性地表达，并定向到任何区室，以靶向胞内蛋白，从而引发特定的生 物学效应（Biocca, 1991)。的确，有些称之为内体（intrabodies)的胞内单链抗体片段， 已被成功地用于调节不同的生物系统中胞内靶蛋白的功能。从而，针对病毒侵染的抗性 已在植物生物技术中得到展示（Tavladoraki, 1993 ;Benvenuto, 1995)，内体与HIV蛋白 的结合业已证明（Rondon, 1997)，并且与癌基因产物的结合（Biocca, 1993 ;Cochet, 1998; Lener，2000)也已有描述。而且胞内抗体在表征目前通过人类基因组测序鉴定到的大量基 因的功能方面有希望成为有价值的工具（Richardson, 1995 ;Marasco, 1997)。例如，它们可 在功能基因组途径中用于封闭或调节新近鉴定的蛋白的活性，由此促成对其功能的了解。 最后，内体具有诊断和治疗应用的潜力，例如在基因治疗环境中。
[0007] 尽管存在极大的前景，功能性内体的产生仍然受限于其不稳定性和不可溶性或者 聚集的倾向。胞浆的还原环境防止形成保守的链内二硫桥，从而使得高百分比的抗体片段 不稳定，因此在细胞内无功能（Biocca, 1995 ;Proba, 1997)。抗体片段的稳定性和可溶性因 此构成了内体在体内作为潜在的蛋白功能调解剂的应用的主要障碍。迄今为止，尚不可预 言使得抗体片段在胞内环境中具备功能的序列要求。
[0008] 因此，急需在广范围的不同细胞类型中性能良好的抗体片段，从而可作为用于多 种结合特异性的构架。此类构架可用于构建用于胞内筛选的文库，或者可作为既有抗体结 合部分的受体。
[0009] 除了独特地满足胞内应用之外，在众多的胞外和体外应用中，基于极为稳定的可 变结构域构架的此类抗体片段或完整抗体相比于其它抗体也具有独特的优势。当此类构 架在氧化环境中产生时，其二硫桥能够形成，进一步增强其稳定性，并使得它们高度抵抗聚 集和蛋白酶降解。体内半衰期（及针对聚集和血清蛋白酶降解的抗性）是除了亲和力和 特异性之外的、使抗体在治疗或诊断应用中成功的唯一最为重要的因素（Willuda，1999)。 抗体片段的半衰期可通过共价连接聚合物分子如聚乙二醇（PEG)而进一步得以提高 (Weir，2002)。这类稳定分子代表了抗体应用的显著进步，尤其但并不仅当不期望F e功能 时。
[0010] 抗体片段文库极大的实践重要性激发了该领域的研究。Winter (EP 0368684)提供 了抗体可变区基因的初始克隆和表达。由这些基因出发，他建立了在互补决定区（CDR)以 及构架区具有高度多样性的巨大抗体文库。不过，Winter未披露不同构架用于文库构建的 用途。
[0011] 另一方面，PlUckthun(EP 0859841)教导试图通过将构架限于有限数目的合成共 有序列而改进文库设计。包括引入大量合理设计的突变的蛋白质工程的努力以前就提示 针对相应共有序列的突变是提高分离的可变免疫球蛋白结构域稳定性的合适手段（Ohage 1999 ;0hage 1999以及US 5, 854, 027,特此并入作为参考）。
[0012] PlUckthun(EP 0859841)公开了基于这些共有序列进一步优化结合亲和力的方 法。PlUckthun专利也承认正在发生着的有关抗体的知识的增长，因此意欲包括此类文库设 计的远景发现。然而，未建议合成共有构架可能的进一步改善。
[0013]因而 Winter、PlUckthun 及他人（如 Soderlind, TO 0175091)的教导试图以 CDR 的高度多样性为焦点建立巨大的抗体文库，用于选择并在氧化条件下应用所选scFv。然而， 所有这些文库未进行胞内应用优化，因而不能用于还原环境或对所表达的抗体片段的稳定 性和可溶性提出特殊要求的其它条件下的选择和应用。
[0014] 抗体片段在还原环境如原核和真核细胞的胞浆中表现良好所需的性质尚不清楚。 因此胞内抗体或"内体"的应用目前受限于其在还原条件下（可影响其稳定性和可溶性能） 不可预测的行为（Biocca, 1995 ;\V6rn，2000)。现有专利申请（EP104020UEP1166121 和 W00200729)及出版物（Visintin，1999)涉及以筛选技术为焦点的内体的胞内筛选，但是未 公开在真核细胞特别是酵母中有功能、从而可用于本上下文的文库构建的具体抗体序列。 [0015]Visintin和Tse独立地描述了所谓的胞内共有序列（ICS)的分离 (Visintin, 2002 ;Tse, 2002)。该序列来自于已从酵母抗原-抗体相互作用筛选中分离出 的许多序列。然而，由于现有噬菌体展示选择，胞内筛选的输入是有严重偏差的。因而， 在Visintin等的例子中，只有一个输入序列属于VH 3亚群。公开的共有序列ICS与由 Knappik(2000)和EP0859841描述的人类VH 3亚群的共有序列完全相同。ICS的62个氨 基酸中的60个也与由Steipe以构建具有增强的稳定性的可变结构域为基础而提出的一般 人类VH-结构域共有序列相同（美国专利号No. 6, 262, 238,特此并入作为参考）。这些工 作依次建立在早期的序列收集（即Kabat, 1991)和可变结构域亚群及结构决定簇的定义 (Tomlinson, 1992 !Williams, 1996 ;Chothia，1989 和 Chothia, 1987)的基础上。然而，由 于所述内体选择的输入是有严重偏差的（即在Visintin等例子中，只有一个VH结构域为 VH3)，由胞内筛选分离VH3序列并不是特别令人惊讶。由于其输入文库的严重偏差，Tse等 和Visintin等的工作未能提供对人类可变结构域所有组成部分的全面评价，而这将会由 无偏差的查询提供，并且这是鉴定存在于人类所有组成部分中的有用内体构架所必需的。 [0016] 我们以前曾描述过不依赖于其抗体_结合特异性而允许在酵母中选择稳定且可 溶的内体的系统（Auf der Maur(2001)，W00148017)。这个途径允许有效地筛选scFv文库 和分离特定构架，它们在酵母细胞的还原环境中是稳定且可溶的。目的仍然是实际分离构 架序列，并且使用的模式是，第一步中预测何种序列类型将会在还原环境中最稳定，而第二 步中通过分析、重组以及进一步的体内和体外实验鉴定最佳序列。
[0017]【发明的简要概述】
[0018] 本发明填补了抗体产生领域缺失的环节。它提供了就稳定性和可溶性而言具有优 异特性的抗体可变结构域构架序列。这些对许多相关应用，例如在诊断、治疗或研究中是关 键特点。这些构架可用于移植既有的结合特异性或者用于产生具有高稳定性和可溶性的抗 体文库。
[0019] ScFv文库被用来分离在酵母细胞的还原环境中稳定且可溶的构架。分离构架的 性能随后在人类细胞系和体外实验中表征。所述构架可直接作为既有结合特异性的受体主 链，或者通过一个或多个高变环的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。分 离的可变结构域序列进一步通过对比进行分析，以鉴定优选的序列家族。从那些优选的可 变结构域序列家族中，根据结构分析选择最佳序列，该结构分析可排除含干扰免疫球蛋白 折叠的构架残基的序列。鉴定的可变结构域序列候选物随后以所有可能的变化重组，并通 过分析其在酵母、哺乳动物细胞和体外的性能挑选最佳的轻链和重链可变结构域组合。
[0020] 这些优化的SCFv及组成它们的可变结构域构架，以及其它抗体片段或由其衍生 的全抗体，举例来说，可理想地作为既有结合特异性的受体主链，或通过一个或多个高变环 的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。适于胞内应用的抗体从定义上来讲 更为稳定且可溶。从而，它们在胞内环境外界的应用中的用途也将具有优势。
[0021] 本发明提供了包括抗体可变结构域构架和单链Fv抗体（ScFv)片段的组合物，其 可掺入到多种抗体片段或全抗体中。提供了最稳定且可溶种类的抗体可变结构域片段，因 而最适于胞内应用。也提供了在胞内测定中表现出最高性能的抗体可变结构域和scFv抗 体片段的具体构架序列。本发明也提供了抗体可变结构域和scFv片段中轻链和重链可变 结构域的人造组合的具体构架序列，举例来说，它们可最理想地用于胞内应用，并且就稳定 性和可溶性而言在体外表现出最佳性能。
[0022] 本发明提供具有如下通式结构的单链构架试剂：
[0023] NH2-VL-接头-VH-COOH 或
[0024] NH2-VH-接头-VL-COOH。
[0025] 在本发明的另一个实施方案中，所述单链构架可融合于第二蛋白成分，以产生具 有如下通式结构的融合构建体：
[0026] NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-COOH
[0027] NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH
[0028] 这些融合构建体中VH和VL区的取向可以颠倒。
[0029] 在本发明的另一个实施方案中，可变结构域可掺入到Fab片段中，其可融合于第 二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体：
[0030] NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH 及 NH2-VL-CL-COOh
[0031] 第二蛋白可融合于重链或轻链的N-端或C-端。
[0032] 在优选的实施方案中，单链或Fab构架融合构建体的第二蛋白是直接或通过转录 激活为胞内测定提供读出的蛋白。
[0033] 本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv 序列，举例来说，它们适于从既有抗体上移植高变环，以便获得在还原或者其它挑战性环境 中具有功能的抗体。
[0034] 本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv 序列，举例来说，通过随机化此类构架的一个或多个高变环，它们适于建立文库用在还原或 者其它挑战性环境中。
[0035] 本发明的另一个目的是所公开的序列在鉴定保守残基和共有序列中的应用。
[0036] 因利用所公开的构架而得的抗体或抗体片段可用作靶确认以及人类、动物和植物 疾病的治疗、预防和诊断中的试剂。所述抗体可以蛋白或编码该蛋白的DNA的形式应用，而 且不限于胞内应用。
[0037] 附图简述
[0038] 图1显示了在啤酒糖酵母中进行质控筛选后的胞内性能。图1显示了通过IacZ 表达的激活而测定的典型的酵母中的"质控"筛选（例如参见实施例1)。在若干不同的筛 选中鉴定到所选的阳性菌落（黑色），并且阳性菌落的相应序列可见于图12和13。所选序 列与阳性对照极为稳定的移植物（深灰）进行了比较。
[0039] 图2显示了在哺乳动物Hela细胞系中所选构架的胞内性能。图2显示了通过与 极为稳定的移植物（深灰）相比的由荧光素酶表达的激活而测定的由典型的酵母"质 控"筛选分离的构架（黑色）在人类细胞系Hela中的性能。阳性对照Gal4_VP16 (白色） 给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。
[0040] 图3显示了在啤酒糖酵母中新构架的胞内性能。图3显示了在酵母中通过IacZ 表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能。构架序列（黑色）与阳性对照（极为稳定 的A-移植物（深灰））进行了比较。构架的编号如图16所述。
[0041] 图4显示了新构架在Hela细胞系中的胞内性能。图4显示了在人类细胞系Hela中 通过荧光素酶表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的A _移 植物（深灰）的比较进行图解说明。阳性对照Gal4-VP16(白色）给出了该系统最大可能 的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。
[0042] 图5显示了在啤酒糖酵母的细胞质中可溶性表达产物。图5显示了通过酵母菌株 酿酒酵母（S. cerevisiae) JPY9胞衆中产生的可溶蛋白的量测定的优良构架组合的体内性 能。
[0043] 图6显示了在E. coli中的表达行为。图6显示了所选构架组合在大肠杆菌 (E. coli)周质中的表达行为。箭头标示对应于这些scFv构架的条带位置。
[0044] 图7显示了所选构架在不同哺乳动物细胞系中的胞内性能。图7显示了在三种人 类细胞系（Hela(黑色）、Saos-2(深灰）及HEK 293(白色））中通过荧光素酶表达的激活 而测定的所选优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的A -移植物的比较进行图解 说明。阳性对照Gal4-VP16给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转 染效率进行了校正。
[0045] 图8显示了在37°C对聚集的抗性。图8代表如在PBS-缓冲液中所示的通过温育 前后存在的单体蛋白的量而定量的所选构架组合在37°C对聚集的抗性。图表A代表构架 2. 4和5. 2,而图表B代表构架