羟脯氨酸免疫原、特异性抗体、检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及羟脯氨酸免疫原、抗羟脯氨酸特异性抗体和羟脯 氨酸检测试剂。
【背景技术】
[0002] 轻脯氨酸（Hydro Proline)，其结构式如式(III)所示： 式(m)
羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的组成成分，占其氨基酸总量的13%，与胶原的螺旋结构形 成并能承受巨大压力有关。羟脯氨酸经脯氨酸羟化酶和羟脯氨酸脱氢酶在肝脏中降解，未 降解的羟脯氨酸由肾脏清除。羟脯氨酸大约有一半由尿排出体外。羟脯氨酸具有多种重 要的生理功能及独特的生物活性，尿液中羟脯氨酸的浓度可代表骨吸收水平，严重骨折、烧 伤、重症肺结核和肝硬化、Hodgkin' s病、甲状腺功能亢进、羟脯氨酸血症，氟骨症都会导致 尿液中羟脯氨酸排泄量的增加，因而测定尿液中羟脯氨酸含量可反应胶原蛋白的代谢情况 及某些疾病对结缔组织尤其是骨组织的损害程度，具有重要的临床参考价值。此外，羟脯氨 酸可作为肺纤维化的特异性指标以及人体衰老检测的参考指标等。
[0003] 目前，羟脯氨酸测定方法主要有：比色法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪法、电泳 法等。但这些方法检测灵敏度相对较低，步骤繁琐，成本较高，不适合临床大量尿液样本的 检测。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的羟脯氨酸检测试剂，尤其是质量好 的自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床检验要求、实用性强、性价比高，可应用于 全自动生化分析仪的羟脯氨酸检测试剂势在必行。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用全新的羟脯氨酸衍生物制备免疫原性 强的羟脯氨酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的羟脯氨酸均相酶免疫检测试剂可以实现在 全自动生化分析仪上对羟脯氨酸高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度 高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低羟脯氨酸检测成本，有利于临床推广使用。
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种羟脯氨酸衍生物。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种免疫原性强的羟脯氨酸免疫原。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种羟脯氨酸免疫原的制备方法。
[0008] 本发明的又一个目的在于提供使用本发明羟脯氨酸免疫原制备得到的特异性强 的抗羟脯氨酸特异性抗体。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供一种羟脯氨酸检测试剂。
[0010] 免疫原性与所合成的羟脯氨酸衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中 羟脯氨酸免疫原的免疫原性较弱，所得到抗体的特异性、与羟脯氨酸的结合力，敏感度都不 如本发明。本发明的羟脯氨酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗羟脯氨酸特异 性抗体。该抗体特异性高，与羟脯氨酸的结合力强。由该抗体制备得到的羟脯氨酸检测试 剂，可以快速、准确地确定样品中的羟脯氨酸含量。本发明是通过以下技术方案实现的： 一种羟脯氨酸免疫原，其结构式如式（I)所示：
式（I) 式中，R为连接基团-(CH2)n-C00-，n是1至20之间的整数，优选R为-(CH2) 5-C00-。
[0011] 载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋 白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。
[0012] 当R为-(CH2)n-COO-时，该羟脯氨酸免疫原的合成途径和方法如下： 1.羟脯氨酸衍生物的制备方法： 一种羟脯氨酸衍生物，其结构式如式（II)所示：
式（II) 式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-,n是1至20之间的整数。
[0013] 取n=5时，该羟脯氨酸衍生物的具体合成步骤如下：
本发明中，羟脯氨酸衍生物的制备过程中选用了 6-溴己酸甲酯为合成原料，故所得的 最终产物羟脯氨酸衍生物的连接基团R为-(CH2) 5-C00-。当n取其他数值时，选用其他6-溴 己酸甲酯的类似物，即直链的、通式为Br- (CH2) n-C00CH3的化合物参加反应时，合成方法完 全一致。
[0014] 2.羟脯氨酸免疫原的制备步骤： (1)将载体蛋白100~300mg溶解于25~75 ml 0? 2 M，pH 8. 5的磷酸缓冲液中； (2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100~300 mg本发明合成的羟脯氨酸衍 生物、1.75~5. 25 ml二甲基甲酰胺、L 75~5. 25 ml乙醇、3. 5~10. 5 ml 10mM，pH 5.0 的磷酸钾缓冲液、100~300 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亚胺、25~75 mgN-羟 基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30~60 min ; (3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原；将合 成好的抗原经过透析进行纯化，得到羟脯氨酸免疫原。
[0015] 本发明中当n取1~20范围内的其他整数时，用上述方法可以制备出如式（I )所 示的羟脯氨酸免疫原。载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白和甲状 腺球蛋白。优选的，载体为血清蛋白。更优选的，载体为牛血清白蛋白。
[0016] 由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的 羟脯氨酸衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数 时，羟脯氨酸衍生物制备的羟脯氨酸免疫原无显著差异，均具备强免疫原性，都能制备高效 价的特异性抗体。
[0017] -种抗羟脯氨酸特异性抗体，由上述的羟脯氨酸免疫原免疫动物后生产得到。
[0018] 所述的抗羟脯氨酸特异性抗体由上述制得的羟脯氨酸免疫原采用常规方法接种 实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下： (1)用PBS将上述合成的BSA-轻脯氨酸免疫原稀释至0. 1~3. 0 mg/ml，得到抗原溶 液，然后用0. 5~5. 0 ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； (2) 2~3周后，再用0. 5~5. 0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实 验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3~6次； (3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000~1:50000的抗羟脯氨酸特异 性抗体。
[0019] 本发明的抗羟脯氨酸特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与羟脯氨酸特异 性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
[0020] 本发明的抗体为采用单一的羟脯氨酸免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗 体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵 羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。
[0021] 本发明提供一种羟脯氨酸检测试剂，含有上述抗羟脯氨酸特异性抗体和指示试 剂。
[0022] 本发明指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指 示试剂为酶试剂，由羟脯氨酸酶标偶联物和酶的底物所组成。
[0023] 上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为 葡萄糖-6-磷酸。
[0024] 羟脯氨酸均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物 和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物与 上述抗羟脯氨酸特异性抗体混合在一起。因此，羟脯氨酸均相酶免疫检测试剂包括两类试 剂： (1) 试剂A由抗羟脯氨酸特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如下： 1) 将2. 018~8. 072g (5. 625~22. 50 mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、 0.856 ~3.4228(5.625 ~22.50 禮)葡萄糖-6-磷酸（6-6-?)用0.5~2155 1111411=8.0 的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物； 2) 将制备的抗羟脯氨酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积 比为 1:100 ~1:10000,优选为 1:1500 ; (2) 试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成，制备方 法如下： 1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH)溶液的制备： a. 称取7. 5~22. 5 mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于6~18mL含有72. 6 mg (0? 05 M) Tris、8mg MgCl2 (3. 3 mM)和 IOOmg NaCl 的溶液中，该溶液 pH=9. 0 ; b. 加入112. 5~337. 5 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)，67. 5~202. 5 mg 葡萄糖-6-磷酸（G-6-P)以及0. 375~1. 125 mL卡必醇； c. 逐滴加入1~3 mL二甲基亚砜； 2) 羟脯氨酸衍生物的激活： a. 在无水状态下称取5~15 mg轻脯氨酸衍生物，溶解于300~900 ML DMF中； b. 使上述溶液温度降到-2 ~ -8°C ; c?加入L 5~4. 5 ML三丁胺； d. 加入0. 75~2. 25 ML氯甲酸异丁酯； e. -2 ~ -8 °C搅拌30~60分钟； 3) G6TOH与羟脯氨酸衍生物的连接： a. 将上述激活的羟脯氨酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6TOH溶液中； b. 2-8°C搅拌过夜； 4) 纯化产物： 通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗 原偶联物，于2-8°C下储存。
[0025] 5)将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8. 2的Tris 缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000,优选为1:1000。
[0026] 本发明的羟脯氨酸免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗羟脯氨酸特异性抗 体特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗羟脯氨酸特异 性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定尿液等生物样品中的羟脯氨酸 含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现羟脯氨酸的高通量快速化 测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检 测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
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