加入终浓度为0. 8mM的 IPTG(Amresco, #0478)于 25°C诱导 12h。
[0029] 镍柱亲和层析纯化（His) 6-HB-EGF :将菌液6, OOOrpm离心5min，去上清，以体积比 菌液：裂解液=20:1的比例将细菌沉淀重悬于裂解液（50mM Tris - HC1，20mM咪唑，IOOmM NaCl，10%甘油，1%曲拉通，ImM蛋白酶抑制剂PMSF，lmg/ml溶菌酶，PH 8. 0)，在冰上静置 30min，200W超声I. 5h，12, OOOg离心30min收集上清得到总蛋白。将总蛋白进行BCA定量 后，以蛋白：Ni-NTA= IOmg: Iml的比例在蛋白液中加入Ni-NTA(QIAGEN，#30210)，在4°C 下结合5h ;600g，4°C离心lmin，去上清；装柱，用裂解液平衡，最后用10倍柱体积的洗脱液 (250mM咪唑，其他组分与裂解液相同）收集洗脱下来的蛋白。
[0030] 肝素亲和层析纯化（His)6-HB-EGF :经镍柱亲和层析纯化之后的蛋白用肝素亲和 层析结合缓冲液（IOmM磷酸钠盐，PH 7.0)透析2次，每次3h。将透析好的蛋白结合于肝素 柱（GE Healthcare，#17-0406-01)，用结合缓冲液平衡，最后用10倍柱体积的洗脱液（IOmM 磷酸钠盐，IM NaCl，PH 7.0)收集洗脱下来的蛋白。
[0031] 肠激酶酶切（His) 6-HB-EGF:经两步亲和层析纯化之后的蛋白用肠激酶（NEW ENGLANDBioLabs，#P8070V)缓冲液（20mMTris-HC1，IOOmMNaCl，2mMCaCl2,PH8.0)透 析3次，每次8h。对透析后的蛋白进行BCA定量后，以质量比为0. 001 %的比例将酶加入蛋 白液中，4°C下反应16h。将酶切后的蛋白混合液重新结合Ni-NTA5h，于流穿液中收集蛋白 液。
[0032] SDS-PAGE和Western Blotting验证蛋白的表达、纯化及酶切：将蛋白样品用 BCA方法定量后，按照每孔加入30-50 yg(纯化后蛋白为2-5 yg)的蛋白量上样。15%聚 丙烯酰胺凝胶（SDS - PAGE) 100V恒压下电泳IOOmin分离蛋白。转膜条件为200mA恒流 60min，将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉将膜封闭Ih后，分别加入鼠源 His 单抗（proteintech，#66005-l_Ig，稀释度为 1:1000)和兔源 HB-EGF 单抗（LifweSpan， #1^-(：166802/44318，稀释度为 1:1000)4°(：孵育过夜，1851'溶液（2011111^18-11(：1，1501111 NaCl，0. 05% [v/v]吐温，PH 7. 3)充分漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的分别抗鼠（Cell Signaling，#7076,稀释度 1:1000)和抗兔的二抗（Cell Signaling，#7074,稀释度为 1:1000)，孵育 lh，ECL 试剂盒（Thermo Scientific，#34080)显色，曝光。
[0033] 目的基因成功克隆进入表达载体后，将重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)筛选得 到重组子，图4A显示在相同大小的位置，只有IPTG诱导的重组子产生了较多蛋白。在此基 础上用Western Blotting进一步验证，图4B显示在相同位置HB-EGF单克隆抗体检测到重 组蛋白（His)6-HB-EGF。蛋白被成功诱导表达之后，经两步亲和层析纯化后的效果如图4C 显示，杂蛋白量很少，目的蛋白的纯度达到80%以上，符合后续实验要求。全长蛋白经过肠 激酶酶切之后，结果如图4B所示用HB-EGF抗体检测到HB-EGF，以及如图4D所示用（His) 6 抗体检测到（His)6标签，表示酶切成功去掉了（His) 6标签，最终得到了蛋白HB-EGF。
[0034] 实施例3.噬菌体展示淘选特异性结合HB-EGF的生物活性肽
[0035] 噬菌体淘选流程如图5所示。
[0036] (1)靶分子固定化：将600 yl浓度为17 μg/ml的靶分子溶液（溶于0? IM的 NaHCO3 PH 8.6)加入六孔板中，置于摇床上轻微振荡，4°C孵育过夜。除去靶分子溶液并用 TBST(50mM Tris-HCl PH 7.5，150mM NaCl，0.1% [v/v]Tween-20)清洗 6 次。最后用封阻 液（0? IM NaHCO3 PH 8. 6,5mg/ml BSA，0. 02% NaN3)封闭 lh。
[0037] (2)噬菌体随机肽库与靶分子结合：除去封阻液，并用TBST (0.1 % [v/v] Tween-20)清洗10次。噬菌体库或扩增后的噬菌体经TBST (0? 1% [v/v]Tween-20)稀释后， 噬菌体的拷贝数理论值在IO9~10 11之间，将稀释好的噬菌体加入到六孔板上使之与靶分 子结合，室温孵育10~60min。
[0038] (3)洗掉未结合噬菌体：TBST (第一轮用0? 1 %，之后都用0? 5 % [v/v] Tween-20) 清洗10次，每次清洗后用力在无菌纸上拍甩，去除残留液。
[0039] (4)洗脱特异性结合噬菌体：将Iml 0? 5mM肝素钠溶液加入六孔板中，室温温和摇 动10~60min。收集洗脱液，即得到被竞争性洗脱下来的特异性结合靶分子的噬菌体。
[0040] (5)噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体加入20ml0D6。。= 0? 01~0?05的ER2738 宿主菌中，37°C剧烈摇晃4h。将培养物转入新鲜离心管中，4°C8,OOOg离心20min，上清液转 入另一离心管中，重复离心。将上清的上部80%转入新鲜离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl(20% [w/v]PEG-8000,2.5MNaCl)，4°C沉淀过夜。再次离心、ImlTBS重悬、PEG/NaCl 沉淀20min之后，将其溶于200yITBS，14,OOOrpm，离心lmin，将上清转移至另一新鲜Ep 管中，即为扩增后的洗脱物。取出Iyl用于滴度测定，其他用来进行下一轮淘选或保存。
[0041] (6)单克隆噬菌体信息的提取：3轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体 感染宿主菌后铺在LB/IPTG/Xgal板上。13h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单 克隆噬菌体扩增。4h后将培养物14, OOOrpm离心30s，取上清，如此重复2次，最后 取8 0 %的上清即为扩增后的单克隆噬菌体。以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物 Forward primer :5'-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3'（SEQ.ID.N0. 5)和 Reverse primer: 5' -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'（SEQ. ID. NO. 6)扩增随机多肽序列，对扩增产物进行测序并 分析各种随机多肽所占比例，然后将候选多肽送金斯瑞公司合成。
[0042] 经三轮噬菌体淘选后，挑取29个噬菌体蓝斑，对其分别进行扩增后收集噬菌体， 设计引物对其随机多肽插入序列进行了 PCR扩增，测序结果如图6所示，共得到了 5种多肽 序列，分别占比例73% (多肽1)，17% (多肽2)，4%，3%，3%。
[0043] 实施例4.多肽抗凝血作用检测
[0044] (1)试管法检测多肽体内抗凝效果：将多肽用生理盐水稀释到500 y g/ml后，通过 尾静脉注射注入昆明小鼠体内200 y 1，注射对照组小鼠200 y 1生理盐水，20min后摘眼球 取血12滴于Ep管中，开始计时，每隔IOs倾斜45°，直至血液不再流动即为凝血时间。
[0045] (2)剪尾法检测多肽体内抗凝效果：将多肽用生理盐水稀释到2000 y g/ml~ 5000 y g/ml后，通过尾静脉注射注入小鼠体内200 y 1，注射对照组小鼠200 y 1生理盐水， 20min后剪掉尾部末端5mm，待第一滴血流出后开始计时，每隔30s观察尾部伤口是否出血， 直至无血流出后即为凝血时间。
[0046] (3) APTT检测多肽体外抗凝效果：兔耳缘静脉取血后，3, OOOrpm离心10min，取无 血细胞血浆 25 y 1，对照组血浆加入 25 y 1 的 PBS (137mM NaCl，2. 7mM KC1，4. 3mM Na2HPO4, I. 4mM KH2PO4, PH 7. 4)，实验组血浆加入 25 y I 200 y g/ml ~500 y g/ml 的多肽后，37°C预 热3min，加入50yl 0&(：12后半自动凝血仪（普利生，C2000-2)自动计时凝血时间。
[0047] 如图7A所示，试管法检测多肽1体内抗凝效果与对照组相比无统计学意义（P = 0. 055)，而多肽2体内抗凝效果显著（P = 0. 011)，故本发明只对有抗凝效果的多肽2进行 进一步验证；图7B剪尾法检测多肽体内抗凝效果结果显示低浓度多肽2抗凝效果不显著 (P = 0. 54)，而高浓度多肽2抗凝血效果具有显著差异（P = 0. 0026);体外检测抗凝效果 如图7C所示，通过APTT检测，多肽2具有抗凝血活性，且呈剂量依赖性，其中低浓度多肽实 验组与对照组差异P = 0. 0032,高浓度多肽实验组与对照组差异P = 0. 0093。综上所述， 多肽2具有抗凝血活性，且在体内外均呈剂量依赖性，而多肽1虽然在淘选出来的多肽中所 占比例最大，却在体内没有明显抗凝血活性。
[0048] 实施例5.多肽2在体内对小鼠毒性作用观察
[0049] 剪尾实验后，将实验组和对照组所有小鼠继续饲养并观察记录其各种行为学指征 变化。结果如表2所示，注射多肽2后，小鼠没有受到明显影响，所记录各项行为学指征均 正常，且一周之后没有发生死亡，表示多肽2注射进入小鼠体内对其没有急性或慢性毒性 作用。
[0050] 表2.多肽2在小鼠体内毒性作用观察
[0051]
【主权项】
1. 一种具有抗凝血活性的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列如I或II所示： I ：TNCVQTRSLCPP； II ：AGAEVEALFNNK〇2. 根据权利要求1所述的具有抗凝血活性多肽在制备体内抗凝血药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的具有抗凝血活性多肽在制备体外抗凝血药物中的应用。4. 一种筛选抗凝血活性多肽的方法，其特征在于，所述方法是以肝素结合表皮生长因 子为靶标，利用噬菌体展示技术，从随机十二肽噬菌体文库中淘选出高亲和力噬菌体，然后 通过竞争性洗脱特异性结合噬菌体，得到具有权利要求1所述的抗凝血活性的随机多肽。5. 根据权利要求4所述一种筛选抗凝血活性多肽的方法，其特征在于，所述淘选过程 中，是以肝素钠为有效成分竞争性洗脱特异性结合噬菌体。
【专利摘要】本发明涉及一种抗凝血活性多肽及通过噬菌体展示技术筛选抗凝血活性多肽的方法，属于抗凝血药物研发与应用技术领域；本发明通过蛋白表达载体的构建、靶蛋白的表达和纯化、靶蛋白的验证、噬菌体展示淘选特异性结合靶蛋白的生物活性肽、多肽抗凝血作用体内体外检测和毒性实验等过程，最终筛选得到的具有抗凝血活性的多肽；这些多肽是以肝素结合表皮生长因子为靶分子，经三轮噬菌体展示技术的淘选，以肝素钠为有效成分洗脱特异性结合靶分子的噬菌体得到的，该多肽可用于制备抗凝血药物；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，且在体内对小鼠无显著的短期和长期毒性，显示其在抗凝血药物研发方面具有重要应用价值。
【IPC分类】C07K7/08, A61K38/10, A61P7/02, G01N33/68
【公开号】CN105175510
【申请号】
【发明人】屠志刚, 廉彩霞, 鲁永金, 刘晗青, 陈克平, 张春霞, 尚东胜, 阮玲玲, 侍海娇, 吴燕芳, 徐莉莉, 丹增曲吉
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月22日