pH6. 8Tris溶解液中，过程 温度不得低于20°C ;
[0062] ⑶按30g氢氧化铝凝胶干粉/kg冷沉淀，于冷沉淀溶解液中加入750g氢氧化铝凝 胶干粉。加入后继续搅拌30分钟，控制温度37°C ;
[0063] ⑷在上述溶液中加入聚乙二醇母液，使得聚乙二醇4000终浓度为4. 0%，搅拌均 匀后用IM醋酸溶液调pH至6. 5 ;继续搅拌60分钟，控制温度37°C ;
[0064] (5)搅拌结束后采用台式离心机提取沉淀上清，离心机转速4200rpm，离心温度 37°C，离心时间30分钟；上清经不锈钢筛网过滤后加0. 45um膜过滤，即得预纯化液。
[0065] 冷沉淀预纯化结果见表1。
[0066] 表1.实施例1、2、3中冷沉淀预纯化结果汇总
[0067]
[0068] 由表1可以看出，采用本发明方法预纯化后，FVIII的比活提高了 3. 69~5. 64倍， 制备得到的预纯化液，其FVIII比活为1. 07~I. 82IU/mg，蛋白含量为5. 9~7. 28mg/ml。
[0069] 以下以实验例的方式来说明本发明的有益效果：
[0070] 实验例1使用本发明预纯化液进一步制备人凝血因子VIII制剂
[0071] 精制方式：按实施例1中冷沉淀预纯化方法获取离心后上清一有机溶剂/去污剂 病毒灭活一阴离子交换层析后检测检测洗脱液中FVIII效价和蛋白含量
[0072] III、检测方法（参照《中国药典》2010版三部附录XN)
[0073] ⑴层析后上清中FVIII效价检测采用ACL7000全自动血凝仪，以人凝血因子VIII 国家标准品为标准，检测FVIII效价；
[0074] 将本发明冷沉淀预纯化获得的离心后上清，经过S/D处理后，用阴离子交换层析 处理，得到洗脱液，进行活性测定，结果见表2 :
[0075] 表2.结合本发明冷沉淀预纯化方法的人凝血因子VIII制备工艺
[0076]
[0077] 由表2可知，采用本发明方法制备的预纯化液，制备得到的FVIII制剂的FVIII比 活平均为85. 77IU/mg，纯度高，临床应用前景良好。
[0078] 实验例2本发明冷沉淀预纯化方法与甘氨酸/氯化钠沉淀纯化方法对比
[0079]I、预纯化方式
[0080] 本发明预纯化方法采用实施例2方法。
[0081] 甘氨酸/氯化钠沉淀纯化方法：
[0082] ⑴取冷沉淀5kg
[0083] 冷沉淀指来源于_20°C以下保存不超过1年的健康人血浆；
[0084] 冷沉淀应为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，提取后应迅速置于_60°C以下保 存，-30°C以下运输。有效期：自冷沉淀取得之日起，有效期为12个月；
[0085] ⑵在搅拌下按1:6的比例将冷沉淀加入30L20mmol/LpH=6. 8Tris溶解液中， 经1. 5小时沉淀完全溶解，过程温度不得低于20°C;
[0086] ⑶然后加入3350ml 2 %氢氧化铝凝胶溶液，继续搅拌5min，15°C离心，上清液澄 清过滤后加入〇? 5mol/L枸橼酸钠溶液至终浓度为0? 02mol/L，用lmol/L HCl调pH至6. 95 ;
[0087] ⑶在上述溶液中加入2. 8mol/L甘氨酸缓冲液至甘氨酸终浓度为lmol/L，搅拌 15min，静置lOmin，室温下离心10min。上清液中加入固体NaCl至终浓度为10%。搅拌 15min，静置lOmin，离心后沉淀溶解于溶解缓冲液中，再离心去掉不溶物，上清可立即用于 制备人凝血因子VIII。
[0088] II检测（参照《中国药典》2010版三部附录XN)
[0089] ⑴检测FVIII效价，比较不同预纯化方式处理后FVIII效价
[0090] ⑵同时检测蛋白浓度，比较不同预纯化方式处理后FVIII纯度
[0091] ⑶本预纯化方法优劣主要采用的判定标准为：FVIII纯度（比活性），其计算公式 如下：FVIII纯度=FVIII效价/蛋白含量
[0092] ⑷本预纯化方法优劣次要采用的判定标准为：工艺复杂性和可操作性
[0093] 检测结果见表3:
[0094] 表3.甘氨酸/氯化钠沉淀法和本发明预纯化对比
[0095]
[0096] 由实验结果可知，从工艺复杂性和可操作性来看，本发明的预纯化工艺采用 Al (OH) 3凝胶干粉代替2 % Al (OH) 3自配溶液，保证沉淀剂质量可控；降低了甘氨酸和氯化钠 的使用量，操作体积仅原来的1/3 ;取消二次离心步骤，只需一步离心即可实现沉淀与上清 的分离，减少设备和人力投入。从制品质量来看，两种预纯化方式中FVIII回收率无显著性 差别，但本发明预纯化方式所获得FVIII比活性明显高于甘氨酸/氯化钠沉淀法，纯化倍数 较高，表明对纤维蛋白原、纤维结合蛋白等杂蛋白去除效果较好。
[0097] 实验结果说明，采用本发明预纯化方法，FVIII的比活提高倍数是甘氨酸/氯化钠 沉淀法的5. 08倍，且操作简单，成本低廉。
[0098] 使用本发明的冷沉淀预纯化工艺对层析前样品纯化效果好，有助于提高后续纯化 步骤的纯化效果，并且预纯化过程中不需要反复调整温度，只需一步离心即可实现杂蛋白 和FVIII料液的有效分离，减少劳动强度和设备投入；沉淀剂均为药用级原料药，减少了自 行配制过程中质量的不稳定和不安全性，易于操作，质量可控。
[0099] 综上所述，本发明冷沉淀的预纯化方法的纯化效果优良，方法简单，易于操作，大 大降低了生产成本，工人劳动强度和资金投入，具有较好的经济和社会效益。
【主权项】
1. 一种冷沉淀的预纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 取冷沉淀，溶解； (2) 加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5~30%w/w，搅拌 15 ~30min; (3) 再加入聚乙二醇至终浓度为3. 0~4. 0%w/v，混勾，调pH为6. 0~6. 5,继续搅拌 15~60分钟； (4) 离心，离心的时间是10~30min，得上清，滤膜过滤，S卩可。2. 根据权利要求1所述的预纯化方法，其特征在于：步骤（1)中，冷沉淀溶解于 20mmol/L、pH6. 8 的Tris溶液中。3. 根据权利要求2所述的预纯化方法，其特征在于：溶液的步骤是：在搅拌条件下，将 冷沉淀加入Tris溶液中，其中，搅拌的频率是80~120rpm。4. 根据权利要求1~3任意一项所述方法，其特征在于：步骤⑴中，溶解时的温度不 低于20°C。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述氢氧化铝凝胶干粉的用 量为冷沉淀的5~15%w/w。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵中，所述搅拌时间为15~20分 钟。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，聚乙二醇是通过加入聚乙二 醇母液的方式加入，其中，聚乙二醇母液中含有30%w/v的聚乙二醇和0. 21%w/v的枸橼 酸钠，且其pH为6. 3。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述搅拌时间为20~40分 钟。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵和步骤⑶中，所述搅拌的频率 是 80 ~120rpm。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，所述离心的时间是15~20 分钟。11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，离心机的转速为3500~ 4200rpm〇12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)~（4)期间，控制温度为20~ 37。。。13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述温度为25~35°C。14. 权利要求1~13任意一项所述的方法制备的预纯化液。15. 权利要求14所述预纯化液在制备人凝血因子VIII制剂中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种冷沉淀的预纯化方法，它包括如下步骤：(1)取冷沉淀，溶解；(2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～30％w/w，搅拌15～30min；(3)再加入聚乙二醇至终浓度为3.0～4.0％w/v，混匀，调pH为6.0～6.5，继续搅拌15～60分钟；(4)离心，离心的时间是10～30min，得上清，滤膜过滤，即可。本发明预纯化方法的纯化效果好，FVIII的比活提高了3.69～5.64倍，而且操作简单，易于操作，质量可控。
【IPC分类】C07K1/30, C07K14/755
【公开号】CN105175483
【申请号】
【发明人】牟蕾, 余伟, 鲁涛, 王黔川, 李伟
【申请人】成都蓉生药业有限责任公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月23日