3-5代细胞制备细胞 悬液。
[0033] 2、细胞分组及处理
[0034] 取生长良好的ECV-304细胞制成细胞悬液，接种于96孔、24孔、6孔细胞培养板或 培养皿中，37°C，5%C0 2培养24h。随机分为六组：①正常组；②H2O2模型组（150ymol/L); ③川芎嗪（TMP) (50ymol/L)+H2〇31 ;④化合物（I ) (10ymol/L)+H202组；⑤化合物（I ) (50 4111〇1/1)+11202组；?化合物（1)(100 11111〇1/1)+11 202组。
[0035] 3、实验项目及检测指标
[0036] 3. IMTT法检测细胞活力
[0037] 将生长良好的ECV-304细胞制备成5XIO4AiL的细胞悬液，按每孔100yL接种 于96孔板，置37°C，5%CO2孵育24h。细胞分组及处理上。继续培养6h和12h后，每孔加 入10yLMTT溶液（终浓度0? 5mg/L)置37°C，5%CO2培养箱孵育4h后，每孔加入100yL DMS0,静置IOmin后振荡60s，30min内置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值（OD5J。
[0038] 按公式：细胞损伤抑制率=(用药组OD57。-模型组OD5J八正常组OD57。-模型组 OD5JX100%，计算细胞损伤抑制率。
[0039] 3.2LDR释放率测定
[0040]取生长良好的ECV-304细胞制成I X IO5AiL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C， 5% C0J?育24h。细胞分组及处理同上。继续培养6h和12h，收集培养上清液。PBS洗涤2 次后，每孔加入 〇.5mL 细胞裂解液（150mmol/L NaCl，150mmol/L Tris-HCI，lmmol/L EDTA， 1% TritonX-100)，于4°C静置15min后振荡数分钟，10000rpm，4°C离心10min收集细胞裂 解液，参照LDH试剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。
[0041] 按公式：LDH释放率=上清液中LDH活性八上清液中LDH活性+细胞裂解液中LDH 活性）' X 100 %，计算LDH释放率。
[0042] 3. 3酶生化法测定MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力
[0043]取生长良好的ECV-304细胞制成IXIO5AiL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C， 5%〇)2孵育2411。细胞分组及处理同上。继续培养1211，收集培养上清液。按10^、3(?、 GSH-Px检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。
[0044] 4、数据处理
[0045] MicrosoftExcel自带的统计软件进行处理，实验数据以..??表示，组间差异用t 检验。
[0046] 三、结果及结论
[0047] 1、化合物（I)对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响
[0048] 正常活细胞线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶，可将淡黄色MTT还原成不 溶于水的蓝紫色的甲腊结晶，结晶数量与活细胞数成正比。本实验结果显示：ECV-304细胞 经H 202(150 iimol/L)氧化损伤6h和12h后，细胞OD值明显降低且与正常组相比具有统计学 意义（P〈0.01)，表明细胞活力下降。而化合物（I )对细胞具有保护作用，能显著抑制H2O2 对细胞的氧化损伤，提高存活率。作用6h，50、IOOy mol/L化合物（I )对细胞损伤抑制率 分别为16.67%(?〈0.05)和28.21%(卩〈0.01)。作用1211，10、50、100 11111〇1/1化合物（1) 对细胞损伤抑制率提高为 24. 85% (P〈0. 05)，29. 64% (P〈0. 01)和 38. 47% (P〈0. 01)。见表1 (*>l<P<〇. Olvs Normal ；#P<0. 05, #P<0.0 lvs H202group ；AP<0. 05, AAP<0.0 lvs TMP group, 下同）。
[0049] 2、化合物（I)对H2O2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响
[0050] 乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2, 4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸 二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色测定反应产物可间接求出乳酸脱氢酶活力。 结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞LDH释放率显著增高（P〈0. 01)。与模型组 比，化合物（1)各组细胞〇)11释放率均减少：10、50、100^111〇1/1化合物（1)作用611，细 胞的 LDH 释放率降为 20.54% (P〈0.01)和 21.22% (P〈0.01) ;50、100ymol/L 化合物（I ) 作用12h，细胞的LDH释放率降为33.64% (P〈0.01)和29.53% (P〈0.01)。化合物（I ) 随浓度的增加，对氧化损伤ECV-304细胞的保护作用也逐渐增强，呈现出一定的量效关系。 结果见表2。
[0051] 3、化合物（I)对H2O2损伤ECV-304细胞MDA含量、S0D、GSH-Px活力的影响
[0052] 实验结果表明：与正常组比模型组ECV-304细胞培养液中MDA含量显著增高 (P〈0.01)。与模型组相比，10、50、100ymol/L化合物（I)组细胞MDA生成量均明显减少， 分别为 3. 00±0. 79nmol/mL(P〈0. 05)，2. 86±0. 75nmol/mL(P〈0. 05)和 2. 69±0. 45nmol/ mL(P〈0. 01)。化合物（I)各浓度组组间对照显示，随浓度的增加，化合物（I)对ECV-304 细胞脂质过氧化损伤的保护作用也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。
[0053] 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞SOD活性显著降低（P〈0. 01)。 与模型组相比，50、100諸〇1/1化合物（1)均可增强￡(^-304细胞的300活性，300活性 分别提高为17. 9±1. 34U/mL(P〈0.05)和19.25±0.81U/mL(P〈0. 01)。且随浓度的增加，细 胞的SOD活性也逐渐提高，表明化合物（I )可增强ECV-304细胞的抗氧自由作用，具一定 量效关系；lOymol/L化合物（I )虽也可提高SOD活性，但不具有显著统计学意义。见表 3〇
[0054] 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞培养液中GSH-Px活性显著 降低（P〈〇.〇l)。与模型组相比，10、50、100ymol/L化合物（I)组细胞GSH-Px活性均 显著提高，分别为 73. 8±10. 3U/mL(P〈0. 05)，92. 2±8. 5U/mL(P〈0. 01)和 102. 5±10. 3U/ mL(P〈0. 01)。且随化合物（I)浓度的增加，ECV-304细胞的GSH-Px活性也逐渐提高，表 明细胞抗氧化作用的能力也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。
[0055] 总结：本实验采用H2O2作为外源性自由基生成系统，能够诱导血管内皮细胞 (ECV-304)氧化应激损伤，促进细胞凋亡。通过MTT法和LDH活性检测证实化合物（I )对 H2O2氧化损伤细胞具有保护作用；通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的测定， 证实化合物（I )有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。
[0056] 表1化合物（I )对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响（土&，n = 8)
[0057]
[0058] 表2化合物（I )对H2O2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响（又土s，n = 8)
[0059]
[0060] 表3化合物（I )对H2O2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响 (S土S.,.n= 8)
[0061]
[0062] 实施例3
[0063] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1: 7的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0064] 实施例4
[0065] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制 成口服液。
[0066] 实施例5
[0067] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0068] 实施例6
[0069] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0070] 实施例7
[0071] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
[0072] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I ):2. 权利要求1所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 款冬花的干燥花蕾粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；(b)步骤（a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再 用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步 骤（b)中75%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依 次用体积比为15:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中 组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗 脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。3. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用85% 乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I )和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I )在制备血管保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备血管保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种高度氧化的二萜化合物及其制备方法和医药用途，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜化合物，可以从款冬花的干燥花蕾中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对H2O2氧化损伤的血管内皮细胞具有保护作用，还具有清除自由基和活性氧的抗氧化特性，可以用来开发成血管保护的药物。
【IPC分类】A61P9/14, A61K31/58, C07J73/00
【公开号】CN105175481
【申请号】
【发明人】黄佳雯
【申请人】黄佳雯
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月26日