I. 60 (dd, J = 23. 5, 10. 8Hz, 1H), L 31 (d, J = 15. 8Hz, 3H), I. 12 (s, 3H), I. 09 (s, 3H).
[0074]【式（D-5-2)所示化合物】按照化合物A-5-2的合成方法以化合物D-4-2 为原料，得到如式（D-5-2)所示的白色固体（86 % )。1H NMR (400MHz, DMS0-d6) 8 5. 37 (dd, J = 11. 0, 8. 3Hz, 1H), 4. 80 (d, J = 3. 6Hz, 1H), 4. 54 - 4. 46 (m, 2H), 4. 29 (d, J =3. 7Hz, 1H), 4. 20(d, J = 6. 9Hz, 1H), 3. 69 (s, 1H), 3. 64 (t, J = 6. 1Hz, 1H), 3. 52- 3. 43 (m, 4H), 3. 42 - 3. 37 (m, 2H), 3. 00 (dd, J = 14. 7, 6. 8Hz, 1H), 2. 69 (dd, J = 15. I, 11. 3Hz, 1H), 2. 28 - 2. 25 (m, 1H), 2. 16 - 2. 10 (m, 1H), I. 86 - I. 77 (m, 2H), I. 73 -I. 67 (m, 4H), L 61 (d, J = 12. 6Hz, 1H), L 55 - I. 46 (m, 1H), L 38 - I. 25 (m, 5H), I. 02 (s, 3H) ,0? 85(s, 3H) 〇
[0075] 实施例4 :表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物抗肿瘤细胞增殖测试
[0076] 采用SRB法在乳腺癌细胞系T47D和人成纤维细胞系HAF中测试本发明的表雄酮 糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物对相应细胞的增殖抑制率。计算半数抑制浓度 (IC 50)进行比较。
[0077] 1、测试原理：
[0078] 磺酰罗丹明B(SRB)是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性 地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合，其在515nm波长处产生吸收峰。在一定吸光度 范围内，吸光度与细胞数量成线性正相关，故可用作细胞数量的定量检测。
[0079] 2、样品测试
[0080] (1)各细胞以适当的密度接种到96孔板上，经过24小时培养后，实验组给予不同 浓度的本发明的衍生物处理96小时，对照组使用正常培养基。
[0081] (2)药物作用96小时后，取出培养板，每孔加入25 yL50% TCA溶液固定细胞，4°C 放置1小时以上。
[0082] (3)取出固定后的培养板，用水冲洗5遍，自然晾干或吹风机吹干后，每孔加入 50yL0. 4%SRB溶液，染色10分钟，弃去染色液，1%冰醋酸洗涤并用吹风机吹干。
[0083] (4)用IOOyL Tris-base碱液（IOmM)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用酶标仪 515nm处测定光吸收值。
[0084] (5) IC5。用 GraphPad 软件计算得到。
[0085] 3、结论
[0086] 各测试化合物对人源乳腺癌细胞T47D分别在0. 2 y M和I y M浓度下的抑制率见 图 1 和表 1，结果表明化合物 A-5-l、B-5-l、C-5-l、D-5-l、A-5-2、B-5-2、C-5-2、D-5-2 均有 较好的抑制乳腺癌细胞T47D增殖的能力，特别是化合物C-5-1 (IC5。= 0. 0696 y M)抑制乳 腺癌细胞T47D增殖的能力明显强于其母体化合物CH21 (IC5。= 1. 22 yM)，以及表雄酮（IC5。 =1. 23 yM)和去氢表雄酮（IC5。= 2. 55 yM)，且对正常成纤维HAF细胞增殖的抑制能力很 小（IC5。= 86. 8 y M)，表现出了对正常成纤维细胞HAF很低的细胞毒性，以及对乳腺癌细胞 系T47D和正常成纤维细胞HAF的极大的选择性（IC MHAF/ICMT47D = 1247)。该选择性与母 体化合物〇121(扣50撤?/扣5(^470 = 32)相比提高了39倍，与表雄酮（扣50撤?/扣5(^470 =35)相比提高了 36倍，与去氢表雄酮（IC50HAF/IC50T47D = 21)相比提高了 59倍。
[0087] 因此，本发明所涉及的表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物可作为一 种潜在的治疗乳腺癌的药物。
[0088] 表1.表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物对乳腺癌T47D细胞以及人 成纤维细胞HAF体外细胞毒活性
[0089]
[0090] 实施例5 :C-5-l抑制乳腺癌细胞系T47D的细胞迀移活性
[0091] 采用微孔滤膜培养小室系统（Transwell试验）测试化合物C-5-1对乳腺癌细胞 系T47D的细胞迀移能力的影响。
[0092] 1、测试原理：
[0093] Transwell小室的底层是一张带有微孔具有通透性的膜，孔径大小为0.1 - 12. 0 y m，本发明采用的是一般常用的聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane)。将 Transwe11小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下 室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞接种在上室内，由于聚碳酸 酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液 中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以 进行共培养、细胞趋化、细胞迀移、细胞侵袭等多种方面的研究。在细胞迀移实验中，可以通 过对滤膜下面的细胞进行计数，来反映细胞的迀移情况。
[0094] 1、化合物抑制迀移活性测试：
[0095] (1)消化并计数处于对数生长期的T47D细胞，细胞重悬在无血清并含有不同浓度 (0,0. 5,2. 5，12. 5yM)待测化合物的基础培养基中，细胞以5xl04个/孔（200 yL)接种至 Transwell小室的上室中，对照组加入等量的基础培养基。下室中则加入600 y L含有对应 浓度待测化合物的完全培养基。
[0096] (2)置于细胞培养箱中培养14h。
[0097] (3)取出Transwell小室用多聚甲醛固定小室细胞20min。
[0098] (4) 2%。结晶紫染液将细胞染色处理5min，清洗小室，将未结合的结晶紫洗掉，用棉 签轻轻擦拭Transwel 1小室的上侧，将未迀移到下侧的细胞擦掉。
[0099] (5)自然干燥，显微镜下拍照，统计多个视野的细胞数目。
[0100] (6)统计数据，细胞迀移率（％)=加药物细胞迀移数/对照组细胞迀移数 *100%〇
[0101] 3、结论：
[0102] 实验结果如（图2)所示，图2表明C-5-1能够在体外实验中以剂量依赖性的方式 抑制T47D细胞的迀移。在12. 5 y M的浓度下，即表现出了与对照组的极显著差异（P〈0. 01); 到25 y M浓度时，对细胞迀移的抑制率达到了 70%左右。
[0103] 实施例6 :C-5-l抑制乳腺癌细胞系T47D的克隆形成实验
[0104] 采用体外克隆形成实验的方法测试化合物对T47D细胞克隆形成能力的影响。
[0105] 1、测试原理
[0106] 细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆 的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有 增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
[0107]2、样品测试
[0108](1)消化处理处于对数生长期的相应细胞，并进行计数，每孔2xl03个细胞接种于 六孔板中，确保接种的细胞分布均匀。
[0109] (2)待细胞贴壁后换液，加入含有不同浓度（0,0. 1，0. 5,2. 5 yM)测试化合物的完 全培养基。
[0110] (3)培养一周后，用吸栗吸掉原来的培养基，磷酸盐缓冲液清洗3次，用多聚甲醛 溶液对细胞进行固定处理（20min)，然后2%。结晶紫染液将细胞染色5min，最后用缓慢流动 的自来水轻轻清洗，以洗掉未结合的结晶紫染液，室温自然干燥。
[0111] (4)显微镜下拍照，计算细胞克隆形成数量
[0112] 3、结论
[0113] 实验结果如图3所示，图3表明C-5-1能够在体外实验中以剂量依赖性的方式抑 制T47D细胞的克隆形成数量和形成克隆的大小。在0.1 yM的浓度下，即表现出了与对照 组的极显著差异（P〈〇. 001);到2. 5 y M浓度时，对细胞克隆形成的抑制率达到了 90%以上。
[0114] 综上，本发明制备的表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物可作为一种 潜在的制备抗乳腺癌的药物。
[0115]本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本 领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保 护范围。
【主权项】
1. 一种表雄酮糖基化衍生物，其特征在于，其结构如式（1)所示：2. -种去氢表雄酮糖基化衍生物，其特征在于，其结构如式（2)所示：3. -种表雄酮糖基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：（1)偶联反应： 将苯甲酰保护的单糖三氯乙酰亚胺酯与表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑环衍生物CH21为 原料，形成糖苷键；（2)脱保护：脱除糖环的苯甲酰基保护基，得到如权利要求1所述的表雄 酮糖基化衍生物。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述苯甲酰保护的单糖三氯乙酰亚胺 酯结构如式（A-3)、（B-3)、（C-3)或（D-3)所示； 所述表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑环衍生物CH21结构如式（m)所示； 所述表雄酮糖基化衍生物的结构如式（A-5-1)、（B-5-1)、（C-5-1)或（D-5-1)所示； 所述制备方法的反应路线如下：5. -种去氢表雄酮糖基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：（1)偶联反 应：将苯甲酰保护的单糖三氯乙酰亚胺酯与去氢表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑环衍生物 CH12为原料，形成糖苷键；（2)脱保护：脱除糖环的苯甲酰基保护基，得到如权利要求2所 述的去氢表雄酮糖基化衍生物。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述苯甲酰保护的单糖三氯乙酰亚胺 酯结构如式（A-3)、（B-3)、（C-3)或（D-3)所示； 所述去氢表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑环衍生物CH12结构如式（η)所示； 所述去氢表雄酮糖基化衍生物的结构如式（A-5-2)、（B-5-2)、（C-5-2)或（D-5-2)所 示； 所述制备方法的反应路线如下：7. 将权利要求1所述的表雄酮糖基化衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。8. 将权利要求1所述的表雄酮糖基化衍生物用于抑制乳腺癌细胞的增殖、迀移或克隆 形成的应用。9. 将权利要求2所述的去氢表雄酮糖基化衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。10. 将权利要求2所述的表雄酮糖基化衍生物用于抑制乳腺癌细胞的增殖、迀移或克 隆形成的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物及其制备方法，将苯甲酰基保护的单糖三氯乙酰亚胺酯分别与C-16、C-17位稠合有噻二唑环的表雄酮和去氢表雄酮进行偶联反应，形成糖苷键；然后脱除糖环苯甲酰基保护基，得到所述表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物。本发明还提供了所述表雄酮糖基化衍生物和去氢表雄酮糖基化衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/58, C07J71/00
【公开号】CN105175478
【申请号】
【发明人】仇文卫, 易正芳, 陈煌, 彭世鸿, 崔海伟, 汪炎, 何小龙, 刘明耀
【申请人】华东师范大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月16日