从龙眼肉中分离木犀草素5-O-β-葡萄糖苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及龙眼肉中分离酚类化合物的方法，尤其涉及从龙眼肉中分离木犀草素 5-0-0-葡萄糖苷的方法。
【背景技术】
[0002] 龙眼被誉为"果中圣品"，有"南方人参"的美称，在我国栽培历史悠久，主要分布 于福建、广西、广东、四川和台湾省，是我国南方的特色大宗水果，其中广东省龙眼种植面积 12. 9万公顷，年产55. 48万吨，对当地农业和经济发展起重要作用。龙眼果肉不仅营养丰 富，并且具有很高的药用功效。《本草纲目》中记载"食品以荔枝为贵，而资益以龙眼为良"， 认为龙眼肉具有"开胃健脾，补虚益智"的功效。中医学著作中也有记载，龙眼果肉可用于 治疗脾虚泄泻，自汗盗汗，心血不足，失眠健忘等症状。已有研究人员对荔枝果肉生物活性 做了初步探索，报道荔枝果肉富含酚类物质具有抗氧化、抗辐射和保护肝脏等生物活性。
[0003] 龙眼资源在我国华南地区非常丰富，如果对龙眼果肉进行深入系统的研究，确定 其抗氧化作用物质基础、鉴定其单体的化学结构、明析其作用机理，并在此基础上开发出可 降低慢性疾病发生发展的功能食品，不仅可以充分利用龙眼资源，而且还可以减少慢性疾 病的发病率、促进人们的健康水平、创造出较大的经济效益和社会效益。已有研究表明，龙 眼果肉中含有丰富的酚类化合物，目前已从龙眼果肉中分离得到的酚类化合物(见下图和 表1)。大量试验表明龙眼果肉中的酚类化合物有较强的抗氧化、延缓衰老功效，是龙眼果肉 抗氧化活性的主要功效物质。Rangkadilok等用70%甲醇从龙眼果肉中提取得到的酚类物 质主要为没食子酸、縣花单宁、縣花酸（Rangkadilok et al.，2005)。Jian Sun用聚酰胺柱 和Sephadex LH-20凝胶柱层析法分离纯化果肉中酚类物质，鉴定得到4-0-甲基没食子酸 和（-)_表儿茶素（Jian et al.，2007)。其中4-0-甲基没食子酸表现出较高的DPPH和自 由基清除活性，而后者证实与龙眼果肉的褐变反应相关。王志远采用普鲁士兰法测定了龙 眼果肉70%丙酮提取物中多酚和单宁的含量分别约为0. 90±0. 06mg/g和0. 56±0. 06mg/g (王志远等，2008)。万红霞比较了不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮对多酚提取含量的影响，结果 显示以70%丙酮为提取剂时，多酚提取量达到最大，为51. 5±1.4mg/100g (万红霞，2011)。 肖毅美用HPLC的方法测定了不同品种龙眼果肉中酚类物质的组成和含量，发现酚类单体 含量最大的是表儿茶素，其次是四甲基邻苯二酚和香豆素（肖毅美，2011)。酚类物质在抗氧 化、延缓衰老等方面具有较强的作用，这与龙眼果肉的生理功效是一致的。
[0004] 目前，没有人从龙眼果肉中分离得到木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从龙眼肉中分离木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷的方法。 该方法工艺简单，条件容易控制，易于产业化，为它在广泛范围内使用提供了方便。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：从龙眼肉中分离木犀草素5-0-0 -葡萄 糖苷的方法，包括以下步骤： (1) 用丙酮提取龙眼果肉，获得丙酮提取物； (2) 所述丙酮提取物上大孔树脂分离柱，先后用超纯水和95%乙醇溶液进行洗脱，收 集乙醇溶液，浓缩至乙醇完全回收； (3) 所述浓缩液上聚酰胺树脂柱，依次用水以及体积分数为10%、20%的乙醇进行梯度 洗脱，而后采用体积分数为25-35%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液； (4) 将25-35%乙醇的洗脱液注入高效液相色谱仪，用甲醇-水进行洗脱，收集含有木 犀草素5-0-P -葡萄糖苷的级分，浓缩，干燥获得木犀草素5-0-P -葡萄糖苷。
[0007] 本发明的一个实施方式，所述步骤（1)具体操作为：取鲜龙眼果肉，按质量体积比 1:2-5加入4°C预冷的80%丙酮，破碎组织，之后用均质机在冰水浴下，4500-5500rpm均质 4-6分钟，然后离心4-6分钟，取上清液，果渣重复提取一次，合并两次上清液，真空浓缩至 40mL，-80 °C冷藏备用。
[0008] 所述离心转速 4500-5500 rpm。
[0009] 所述步骤（2)中的超纯水和95%乙醇溶液的用量分别为2L。
[0010] 所述步骤（3)中的水和乙醇的用量分别为2L。
[0011] 所述步骤（4)中甲醇-水中甲醇和水体积比为45 : 55 ;流速5 mL/min，所述干燥 为冷冻干燥。
[0012] 本发明的有益效果： 1.本发明龙眼果肉丙酮提取物经大孔吸附树脂出去糖类化合物后，采用聚酰胺吸附树 脂与高效液相色谱相结合的方式进行纯化，实现了木犀草素5-0-P -葡萄糖苷的快速高效 分离，且所得的木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷纯度可达到95%以上。
[0013] 2.本发明获得的木犀草素5-0-0 -葡萄糖具有细胞的抗氧化能力。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明30%乙醇洗脱液的高效液相色谱图。
[0015]图2是本发明提取的木犀草素5-0- P -葡萄糖苷的核磁共振H谱图，各个H质子 的信号位移值（ppm)示于图中。
[0016]图3是本发明提取的木犀草素5-0- P -葡萄糖苷的核磁共振C谱图，各个C原子 的信号位移值（ppm)示于图中。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 实施例一 (1)取500g鲜龙眼果肉，按质量体积比1:2加入4°C预冷的80%丙酮，采用飞利浦搅 拌机破碎组织，之后用XHF-D均质机在冰水浴条件下，5000 rpm转速下均质5分钟，均质后 5000rpm离心5min，取上清液。果渣再重复提取一次。合并两次离心上清液，真空浓缩至约 40mL，龙眼果肉提取物浓缩液在-80 °C冷藏备用。
[0019] (2)龙眼果肉提取物浓缩液首先采用填充了 HPD-826型大孔树脂，直径3. 5cm，长 40cm玻璃柱进行分离，分别用2L超纯水和2L 95%乙醇溶液（v/v)进行洗脱。收集有机相 洗脱液，真空浓缩有机相洗脱液。
[0020] (3)将有机相浓缩液用填充了聚酰胺树脂（PR)，直径3. 5cm，长40cm玻璃柱作进 一步纯化，依次采用水和以下体积分数的乙醇溶液进行洗脱：10%、20%、30%、40%、50%、80% 和100%，各洗脱液均为2L，分别收集洗脱液，各洗脱液采用HPLC进行分析，HPLC分析采用 二极管阵列检测器（DAD)。与木犀草素5-0-P-葡萄糖苷标准品进行比较发现，只有30%乙 醇洗脱液中含有木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷，如图1所示，该图横坐标表示出峰时间，从左 到右出峰时间依次为17. 864, 25. 421，28. 272, 29. 688, 34. 828。其中，在25. 421分钟处出现 的是木犀草素5-0-0 -葡萄糖苷的峰。
[0021] (4)将30%乙醇洗脱液注入高效液相色谱仪，液相色谱条件：检测波长280nm ;流 动相甲醇-水比例45:55，v/v ;流速5mL/min。收集25分钟出峰段的洗脱液，浓缩，干燥获 得单体，避光干燥器中保存备用。
[0022] 产物结构鉴定： 对所得的单体进行1H NMR、13C NM