烟草中一种具有抗烟草花叶病毒活性的倍半萜类化合物、其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的倍半萜类 化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法和其在抗烟草花叶病毒中的用途。
【背景技术】
[0002] 植物病毒是仅次于真菌的一类病原物，是迄今为止人们发现的最小微生物之一。 植物病毒是内含感染性核酸，外披蛋白质外壳的实体，其特征是能感染寄主细胞和通过感 染引起病害现象。常见的植物病毒病约有1000多种，多由716种植物病毒造成，植物病毒 的危害仅次于真菌。植物病毒病一直是农业生产中的一大危害，素有植物"癌症"之称，由 于病毒在植物细胞中绝对寄生，其复制所需的物质、能量、场所完全依赖寄主，且植物没有 完整的免疫代谢系统，使得植物病毒病的防治较为困难，给农业生产造成了极大损失。因此 病毒病的防治成了全球植物保护工作面临的重要问题，也是植物病毒理论和实践中的重要 研究领域。
[0003] 烟草是一种经济作物，由烟草花叶病毒引起的烟草病害是世界各烟区的重要病毒 病害，烟草花叶病毒病严重影响了烟叶的产量和质量。据报道，全球每年仅因烟草花叶病毒 病造成的损失就达1亿多美元。为了寻找较好的防治植物病毒病的资源，人们进行了多方 面的探索和研究。
[0004] 倍半萜（sesquiterpenes)是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物。倍半萜 类化合物分布较广，在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高 沸点部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重 要原料，也是重要的植物源性药物来源之一。为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研 究和开发更多的倍半萜类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从云南 烤烟烟叶中分离得到了一种新的倍半萜类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得 一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病病毒活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的倍半萜类化合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种制备所述倍半萜类化合物的方法。
[0007] 本发明的目的还在于提供所述倍半萜化合物在抗烟草花叶病毒中的用途。
[0008] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
[0009] 本发明第一方面涉及一种从烟草中分离的倍半萜类化合物，其具有下述结构式：
[0010]
[0011] 该化合物的命名为（2R, 3S) _2, 3_二氛-3-羟基-6-异丙基_2, 4, 7_二甲基 讳-1-酮，分子式为 C15H2Q02。其英文名为：[(2R, 3S) -2, 3-dihydr0-3-hydroxy-6-isopropy 1-2, 4, 7-trimethylinden-1-0ne]，为浅黄色胶状物。
[0012] 本发明第二方面涉及一种根据本发明第一方面所述的倍半萜化合物的制备方法， 该制备方法包括以下步骤：
[0013] (1)制备烟草提取物浸膏：以烟草烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，并用第一 溶剂浸泡并提取所述烟叶3~5次，每次24h~72h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所 述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂是选自甲醇、乙醇或丙酮的有机溶剂与水的混合物， 当所述第一溶剂为甲醇或乙醇与水的混合物时，其中甲醇或乙醇占该第一溶剂的80wt%~ IOOwt %，当所述第一溶剂为丙酮与水的混合物时，其中丙酮占该第一溶剂的60wt %~ 90wt% ;且第一溶剂：烟草=(2-4) : (4-6)，重量比；
[0014] (2)硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏与其2-4重量倍的160~300目硅胶混 合后干法装柱，然后用体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮 溶液进行梯度洗脱，将其中体积为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液称为第一洗 脱液；
[0015] (3)高压液相色谱分离纯化：将上述第一洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯 化，该高压液相色谱采用21. 2mmX250mm、5 ym的C18色谱柱，流动相流速为20mL/min，流动 相为55%的甲醇，紫外检测器检测波长为283nm，第一洗脱液每次进样200 yL，每次进样后 色谱峰保留时间为25. 2min时所对应的洗脱液，称为第二洗脱液，将该第二洗脱液脱除溶 剂后即得所述倍半萜化合物。
[0016] 在本发明优选的实施方案中，所述制备方法还包括以下进一步提纯的步骤：将在 所述高压液相色谱分离之后得到的所述倍半萜化合物再次溶于纯甲醇，并以纯甲醇为流动 相，通过凝胶柱进行层析分离，得到进一步提纯的所述倍半萜化合物。
[0017] 在本发明优选的实施方案中，所述制备方法步骤（2)中，在与所述160~300目硅 胶混合之前，先将所述烟草提取物浸膏用其1. 5~3重量倍的选自纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮 的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的〇. 8~1. 2重量倍的80~100目硅胶拌样。
[0018] 本发明第三方面涉及根据本发明第一方面所述的倍半萜类化合物在制备抗烟草 花叶病毒药物中的用途。
[0019] 本发明优点如下：本发明的倍半萜类化合物结构新颖，且具有抗烟草花叶病毒活 性，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明倍半萜类化合物的核磁共振碳谱；
[0021] 图2为本发明倍半萜类化合物的核磁共振氢谱；
[0022] 图3为本发明倍半萜类化合物的主要HMBC相关图示。
【具体实施方式】
[0023] 本发明所制备的倍半萜类化合物的结构是通过以下方法测定出来的。本发明化合 物为浅黄色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），X _ (log e ) 283 (3. 25)，248 (3. 59)，210nm ; 红外光谱（溴化钾压片）v nax 3360, 1683, 1600, 1542, 1465, 1347, 1215, 1058, 890, 575cm S 高分辨质谱011?3頂3)给出准分子离子峰111/2 231.1393[11-11](计算值231.1385)。结合 1H和13C NMR谱给出一个分子式C15HmO2，不饱和度为6。从1H和13CNMR谱（数据归属见表 1)信号可以看出化合物中有一个1，2, 3, 4, 5-五取代的苯环、一个异丙基、3个甲基、一个 氧化次甲基、一个次甲基，一个酮羰基；除去苯环的不饱和度4,羰基的不饱和度1，化合物 中还应有一个环。根据 H-3 和 C-9、C-2、C-l、C-4、C-8,以及 H-2 和 C-l、C-3、C-8、C-9 的 HMBC相关（图3)可证实C-l、C-2和C-3与苯环间形成了一个5元碳环，该化合物为二氢 茚-1-酮类结构。化合物的母核确定后，剩余的甲基、异丙基和羟基为母核上的取代基。根 据H-IO和C-5、C-6、C-7，H-11，12和C-6,以及H-5和C-IO的HMBC相关可证实异丙基取代 在母核的C-6位；根据H-13和C-l、C-2、C-3,以及H-3和C-13的HMBC相关，可证实该甲基 取代在母核的C-2位；根据H-14和C-4、C-5和C-9,以及H-5和C-14的HMBC相关，可证实 该甲基取代在母核的C-4位；根据H-15和C-6、C-7和C-8的HMBC相关，可证实该甲基取 代在母核的C-7位；此外化合物中还应有一个羟基取代在母核的C-3位，以满足化合物中存 在氧化的次甲基。化合物的比旋光度k]r为+14. 8,且其⑶谱在326. 8nm处有正的科顿效 应[Anax( A e )326. 8(+18. 2) nm]，和文献（J. Nat. Prod. 2011,74, 2010 - 2013)对比可证实 化合物中两个手性碳的构型为2R，3S。至此本化合物的结构得以确定。
[0024] 表 1?化合物的1HNMR和13CNMR数据（CCl3)
[0025]
[0026] 本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定为倍 半萜类化合物，并表征了其具体结构。采用半叶法进行了本发明化合物的抗烟草花叶病毒 活性测试，结果表明本化合物的相对抑制率为45. 6%，超过了阳性对照宁南霉素的相对抑 制率31. 5%，说明本化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性。活性检测结果揭示了本发明 的化合物在制备抗轮状烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明的化合物结构简 单、活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗烟草花叶病毒药物 制剂研发。
[0027] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明 加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0028] 本发明所用原料不受地区和品种限制，任何来源地的烟草均可以实现本发明，下 面以来源于云南中烟工业有限责任公司不同产地的烟草原料对本发明做进一步说明。除非 另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
[0029] 实施例1
[0030] -种倍半萜类化合物C15HmO2的制备方法，具体包括以下步骤：
[0031] (1)制备烟草提取物浸膏：以烟草烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，并用第一 溶剂浸泡并提取所述烟叶4次，每次54h，将提取液合并、过滤并浓缩后得到所述烟草提取 物浸膏；其中所述第一溶剂是选自甲醇、乙醇或丙酮的有机溶剂与水的混合物，当所述第一 溶剂为甲醇或乙醇与水的混合物时，其中甲醇或乙醇占该第一溶剂的95wt%，当所述第一 溶剂为丙酮与水的混合物时，其中丙酮占该第一溶剂的70wt% ;且第一溶剂：烟草=3:5， 重量比；
[0032] (2)硅胶柱层析：将所述烟草提取物浸膏用其2. 5重量倍的选自纯甲醇、纯乙醇 或纯丙酮的第二溶剂溶解后与为烟草提取物浸膏的1. 2重量倍的80~100目硅胶拌样， 再与烟草提取物浸膏3重量倍的250目硅胶混合后干法装柱，然后用体积比依次为1:0、 20:1、9:1、8:2、7:3、6: 4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，将其中体积为8:2的 氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液称为第一洗脱液；
[0033] (3)高压液相色谱分离纯化：将上述第一洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯 化，该高压液相色谱采用21. 2mmX250mm、5 ym的C18色谱柱，流动相流速为20mL/min，流动 相为55%的甲醇，紫外检测器检测波长为283nm，第一洗脱液每次进样200 yL，每次进样后 色谱峰保留时间为25. 2min时所对应的洗脱液，称为第二洗脱液，将该第二洗脱液脱除溶 剂后即得所述倍半萜化合物。
[0034] 所述制备方法还包括以下进一步提纯的步骤