丙种球蛋白在0. 5mol/L至3. Omol/L范围内变化并不明 显，增加幅度不大，但当盐浓度增加时，HSA的吸附量明显增加，当浓度增加至3. Omol/L时， 吸附量几乎达到39. 8 y g/mg，其可能作用机理为：由于新型介质化3〇4@Si〇2基质为纳米级 磁性微球，使得其具有高的配基修饰密度，运样，疏水电荷诱导吸附剂的配基与目标蛋白在 低盐浓度下即可通过疏水作用及特异性作用实现较大的吸附容量；而对于杂蛋白HSA由于 其弱的疏水性和非特异性作用，配基对其基本不吸附，当盐浓度继续增大，具有疏水电荷诱 导性质的配基与蛋白间疏水作用也逐渐增强，直至达到最大吸附量，而当盐浓度继续增大 后，蛋白的疏水基团也逐渐暴露出来，使得蛋白与配基之间的疏水作用力也逐渐增强，解离 常数也随之降低。由实验结果可W看出，具有强疏水性和特异性吸附作用的目标蛋白，盐浓 度变化对其影响不大，运在某种程度上与疏水电荷诱导吸附剂的非盐依赖特性相符合。
[0070] 实施例7
[0071] W琉基乙基化晚为配基的化3〇4@Si〇2-S-MEP磁性复合微球对血清中免疫球蛋白 (IgG)的选择性吸附
[0072] 准确称取适量化3〇4@Si〇2-S-MEP磁性复合微球，加入适量血清，再用平衡液稀释至 7mL。然后放于摇床中，在室溫下缓慢震荡吸附比。接着进行磁分离，留存上清液于4°C冰箱 中；接着用7mL平衡液对磁性娃球进行超声清洗2min，磁分离，留存清洗液，放于4°C冰箱。 接着向离屯、管中加入7mL不同抑的洗脱液，再放置摇床中震荡洗脱化，磁分离，留存洗脱液 于4°C冰箱中待用。最后，利用SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶电泳对上述各步骤中的磁分离倾 出液进行电泳分析。 阳〇7引图9为化化@Si〇2-S-MEP磁性复合微球对血清中IgG的分离纯化电泳图，Lane 1 : 标准IgG ;Lane 2 :标准HSA ;Lane 3 :血清原样；Lanes 4-7 :洗脱液（抑分别为6、5. 5、5、 4)，从图8可W看出，血清原样中含有大量杂蛋白，主要为HSA，经过化^@Si〇2-S-MEP磁 性复合微球吸附后，经过不同抑的洗脱液洗脱可W看出，该化3〇4@Si〇2-S-MEP磁性复合 微球可W对血清中的IgG进行选择性吸附，而杂质蛋白如HAS等却不被吸附，采用本发明 的Fe3〇4@Si〇2-S-MEP磁性复合微球对血清中的IgG可实现一步分离富集和纯化，纯度大于 95%。
[0074]实施例8 阳0巧]W琉基乙基化晚为配基的化3〇4@Si〇2-MEP磁性复合微球对鸡卵黄中免疫球蛋白 (I讯的选择性吸附
[0076] 采用实例7中的处理方法，用化3〇4@Si〇2-S-MEP磁性复合微球对鸡卵黄中免疫球 蛋白（I讯进行选择性吸附。图10为化化@Si〇2-S-MEP磁性复合微球对鸡卵中I巧的分 离纯化电泳图。从图10中可看出，当抑降至5时，没有目标蛋白I巧被洗出，随着抑的降 低磁性微球表面和蛋白质表面开始带有正电荷，疏水相互作用逐渐减弱而静电排斥作用逐 渐增强，被吸附的蛋白逐渐被洗脱下来。当抑降低至4后，在洗脱液中包含目标蛋白I巧， 且杂蛋白很少。当抑降至4且加入少量尿素后大量的目标蛋白I巧被洗脱下来。
【主权项】
1. 一种磁性复合纳米粒子，其特征在于，所述磁性复合纳米粒子为Fe 304@ SiO2-S-MEP (MEP为乙烯基吡啶）或Fe3O4O聚合物-S-MEP，以SiO2或聚合物包覆的磁性复合 纳米粒子Fe 3O4OSiO2S Fe 304@聚合物为基质，配基为经硅烷偶联剂巯乙基三甲氧基硅烷通 过巯基-烯点击反应偶联的乙烯基吡啶，其结构组成为：2. 根据权利要求1所述的一种磁性复合纳米粒子，其特征在于，所述一种磁性复合纳 米粒子是一种以乙烯基P比啶为配基，对抗体具有选择性吸附的磁性复合纳米粒子，所述的 磁性复合纳米粒子以具有超顺磁性的Fe 3O4纳米粒子为核，包覆的SiO 2或聚合物为壳的 核-壳结构，Fe3O4OSiO2S Fe 304@聚合物磁性复合纳米粒子，粒径为50~lOOOnm，所述的乙 烯基吡啶包括4-乙烯基吡啶、3-乙烯基吡啶、2-乙烯基吡啶。3. 根据权利要求1所述的一种磁性复合纳米粒子，其特征在于，所述磁性复合纳米粒 子具有疏水电荷诱导固相吸附剂的性质，是一种疏水电荷诱导磁性吸附剂，配基含有一个 可离子化的吡啶环和一个含有硫元素的疏水尾部，在pH值为7-8时，吡啶环不带电，MEP与 抗体通过温和的疏水相互作用结合，当pH降低后，吡啶环带上正电荷，此时抗体由于pH低 于它的等电点也带上相同的正电荷，当静电排斥作用大过疏水作用时，抗体就从介质上洗 脱下来。4. 根据权利要求1所述的一种磁性复合纳米粒子，其特征在于，在进行特异性吸附时， 将含有特异性抗体的样品，如血液、血清、血浆、腹水、细胞培养液、乳液、生物工程表达的单 克隆抗体或卵黄等生物原料中免疫球蛋白粗提物等与本方法制备的磁性复合微球混合，在 缓冲溶液存在的情况下于室温下振荡吸附一小时，待特异性抗体与相应的免疫球蛋白结合 后，分别用清洗液和洗脱液洗掉非特异性结合的抗体和杂蛋白，最后采用特定的洗脱液洗 脱特异性吸附的免疫球蛋白，得到特异性的IgG或IgY。5. -种磁性复合纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一：采用SiO2或聚合物对Fe A磁性纳米粒子进行包覆，制备Fe AOSiO2S Fe 304@ 聚合物磁性复合纳米粒子；以Fe3O4磁性纳米粒子为核，以正硅酸乙酯TEOS为硅源采用溶胶 凝胶法制备尺寸可控的核壳结构的Fe 3O4OSiO2磁性复合粒子，或者以Fe 304磁性纳米粒子为 核，以聚合物为壳，制备Fe3O 4O聚合物磁性复合粒子； 步骤二：将硅烷偶联剂巯乙基三甲氧基硅烷键合到复合磁性纳米粒子的硅胶表面，得 到表面带有疏基的Fe3O4OSiO2磁性复合纳米粒子；以Fe 304@Si02复合磁性粒子为基质，以甲 苯为溶剂，加入〇. Ig 4-巯乙基三甲氧基硅烷搅拌，加热至回流，制得表面含巯基的Fe3O4O Si0 2·性复合微球或表面含巯基的Fe 304@聚合物磁性复合纳米粒子； 步骤三：基于巯基-烯点击反应制备Fe3O4OSiO2-S-MEP或Fe 3O4O聚合物-S-MEP磁性复 合纳米粒子；复合纳米粒子表面生成的巯基在甲苯中以偶氮二异丁腈（AIBN)为引发剂，缓 慢加入lmL4-乙烯基吡啶搅拌反应30h，与含双键的乙烯基吡啶（MEP)进行巯基-烯点击化 学反应，制备得到对抗体具有选择性吸附的Fe 3O4OSiO2-S-MEP或Fe3O4O聚合物-S-MEP磁性 复合纳米粒子吸附剂。
【专利摘要】本发明涉及一种对抗体具有选择性吸附的磁性复合纳米粒子，其结构式为：该方法以具有超顺磁性的Fe3O4纳米粒子为核，以正硅酸乙酯为硅源，用SiO2或聚合物对Fe3O4磁性纳米粒子进行包覆，制备得到核壳结构的Fe3O4SiO2或Fe3O4聚合物磁性复合粒子；将硅烷偶联剂巯乙基三甲氧基硅烷键合到该磁性复合粒子的硅胶表面，再与含双键的乙烯基吡啶(MEP)进行巯基-烯点击反应，制备得到Fe3O4SiO2-S-MEP或Fe3O4聚合物-S-MEP磁性复合纳米粒子吸附剂。本发明所制备的Fe3O4SiO2-S-MEP或Fe3O4聚合物-S-MEP磁性复合纳米粒子是一种对抗体具有选择性吸附的新型生物功能化的磁性复合纳米材料。该材料有很好的超顺磁性，可在外加磁场的作用下，迅速实现固液分离。同时又表现出对抗体吸附的特异性，可用于抗体的快速分离与制备。
【IPC分类】B01J20/26, B01J20/30, B01J20/28
【公开号】CN105170110
【申请号】
【发明人】白泉, 倪倩
【申请人】西北大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年5月18日