一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物材料技术领域，设及一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海 绵及其制备方法，具体设及一种在动物跟腫中具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是由3条肤链梓成螺旋形的纤维状蛋白质，胶 原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%W上。存在于几乎所有组织 中，是一种细胞外基质蛋白，W不溶纤维形式存在，具高度抗张能力，对动物和人体皮肤、血 管、骨、软骨的形成十分重要，是结缔组织的重要物质，是决定结缔组织初性的主要因素，胶 原蛋白也是细胞外基质中最重要的组成部分。
[0003] 胶原蛋白和其他蛋白一样也是由氨基酸组成的，但在其组成中甘氨酸几乎占到了 1/3,并且脯氨酸和径脯氨酸是各类蛋白质中最高的，正因为氨基酸的组成特点，胶原蛋白 在空间中W稳定的=螺旋结构存在。胶原蛋白具有诸多优异的生物学性质，如低免疫性：胶 原分子结构中的重复性单元大，免疫原性非常低，对机体无排异反应，亲和性好，一般生物 机体不会对其产生慢性的排斥现象。
[0004] 其中，胶原蛋白海绵为白色海绵状固体，是胶原蛋白的一种。作为常用的医疗耗 材，具有充当填充物，快速止血，防止粘连，加速伤口愈合等功效，减少术后并发症，在医疗 上用途广泛。其主要利用了胶原特殊的四级结构，从而使血小板活化、释放出颗粒成分，迅 速凝血，在正常血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛 细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损时，血小板的止血兼有机械性堵塞伤口和 化学性粘附聚集作用。首先，血小板迅速粘附于暴露的胶原纤维（血小板膜上的糖蛋白 GPIIb-IIIa,由VWF介导与胶原结合），此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的 圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集（血小板膜上的糖蛋白GPIIb-IIIa由胶 原介导发生相互粘附聚集），此为血小板第一相聚集，促进血小板聚集的主要物质是胶原、 损伤内皮细胞的二憐酸腺巧和已形成的微量凝血酶；血小板的二憐酸腺巧可加速血小板的 聚集、变性，成为不可逆的第二相聚集，形成白色血栓，构成初步的止血屏障。
[0005] 同时，胶原激活人体内源性凝血途径：当血管发生损伤，皮下组织暴露，M因子与 带负电荷的皮下胶原接触就被激活为Ma,少量Ma与HMK可使PK转变为激肤释放酶，后 者又可与HMK-起迅速激活大量M曰，Ma又同时激活因子VI，因子VI与Ca2\因子W共同 形成复合体，从而激活因子X为Xa,继而在Ca2+参与下激活凝血酶原为凝血酶，凝血酶激 活纤维蛋白原为纤维蛋白，然后凝固形成血栓，达到止血效果。
[0006] 但是，由于从不同组织中分离纯化得到的胶原蛋白在纯度、理化性质和胶原蛋白 构型方面有显著的差异，其吸水速率慢，吸水倍率低，力学强度低，生物活性差。因此本发明 选择生物体内含量最为丰富的动物跟腫作为原材料，同时，针对原料中的可能存在的危险 因素在生产过程进行控制，W便获得具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵。
【发明内容】
[0007] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有生物活性的胶原 蛋白海绵及其制备方法，用于解决现有技术中缺乏高纯度、生物活性结构、生物相容性良 好、表面平整细腻、质地柔软、富有弹性等特点的胶原蛋白海绵的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种具有生物活性的胶原 蛋白海绵的制备方法，包括W下步骤：
[0009] 1)取动物跟腫，清洗、冰冻切片后除脂、清洗，备用；
[0010] 优选地，所述动物跟腫为牛、马、羊、猪等动物的跟腫。更优选地，所述动物跟腫为 牛或马的跟腫。
[0011] 优选地，所述动物跟腫要剔除筋膜。所述剔除筋膜目的在于初步除去脂肪和其他 杂蛋白。
[0012] 优选地，所述冰冻为成束整装冰冻。
[0013] 所述成束整装是将剔除筋膜并用水清洗后的动物跟腫按顺序并排在一起，捆成束 处理。
[0014] 更优选地，所述冰冻在低溫冰箱中进行。所述低溫冰箱为医学生物领域中常规使 用的低溫冰箱。
[0015] 更优选地，所述冰冻的条件为：冰冻溫度：-20至-40°c;冰冻时间> 12h;所述动物 跟腫避免反复冻融。
[0016] 优选地，所述切片采用切片机将冻好的跟腫束切成薄片。所述切片机为医学生物 领域中常规使用的切片机。
[0017] 更优选地，所述薄片的厚度为0. 5-5mm。所述薄片切片时只管厚度，体积由牛筋本 身形状决定。
[0018] 优选地，所述除脂是将跟腫片用除脂液浸泡后再用水清洗。
[0019] 更优选地，所述除脂液为碳酸氨钢与乙醇水溶液的混合液。所述除脂液能够去除 跟腫片上的脂肪。
[0020] 最优选地，所述除脂液中所含碳酸氨钢的终浓度为0. 5-5% (m/V)，所含乙醇的终 浓度为70-90% (V/V)。所述终浓度是指溶液中溶质的最后浓度。
[0021] 更优选地，所述除脂液浸泡条件为：浸泡次数：2-5次；浸泡时间：15-30min。
[0022] 更优选地，所述跟腫片与除脂液加入的质液比为1 :10-25(g/mL)。
[002引。取步骤1)的跟腫化分散于水中，再加入膜蛋白酶处理并清洗；
[0024] 优选地，所述含跟腫片的水的抑值调整为8. 0-8. 5。所述抑值调整采用碱液调 整。所述碱液为氨水或氨氧化钢水溶液。
[0025] 优选地，所述跟腫片与水溶液的质液比为1 :10-100(g/mL)。
[002引优选地，所述膜蛋白酶与水加入的质液比为25-250 :100000 (g/血）。即所述膜蛋 白酶加入到水中，形成膜蛋白酶水溶液的浓度为0. 025-0. 25% (m/v)。
[0027] 优选地，所述膜蛋白酶处理条件为：反应溫度：35-40°C，优选为37°C;反应时间： 0. 5-2h。所述跟腫片与膜蛋白酶反应，能够去除跟腫片中的部分杂蛋白。
[0028] 优选地，上述步骤1)或2)中，所述清洗均为用水清洗。所述用水清洗时，使跟腫 片的抑值与纯化水的抑值接近，调整抑值至7,为中性。
[0029] 更优选地，所述用水清洗条件为：清洗时间：3-10min，次数：2-5次。
[0030] 3)取步骤2)的跟腫片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反应后收集 酶解液；
[0031] 优选地，所述跟腫片与酸加入的质液比为1 :50-150 (g/mL)。
[0032] 优选地，所述酸选自乙酸、盐酸中的任意一种。所述酸为抑=2-4的稀酸水溶液。
[0033] 更优选地，所述乙酸（醋酸）水溶液的摩尔浓度为0.1 -IM ;所述盐酸水溶液的摩 尔浓度为0.01-0. 1M。
[0034] 优选地，所述酸浸泡时间为0.5-地。所述酸浸泡能够使跟腫片充分溶胀。
[0035] 优选地，所述分散是将跟腫片与酸充分混合均匀。从而使成团的跟腫片均匀的分 散在稀酸溶液中，便于在提取时更充分更均匀的反应。
[0036] 优选地，所述分散采用组织捣碎机进行。所述组织捣碎机为医学生物领域中常规 使用的组织捣碎机。
[0037] 优选地，所述跟腫片与胃蛋白酶加入的质量之比为20-200 :1。更优选的，所述跟 腫片与胃蛋白酶加入的质量之比为50-150 :1。
[0038] 优选地，所述酶溶解的条件为：反应溫度：0-20°C;反应时间：24-96h;揽拌周期： 每隔比揽拌5-15min;揽拌速率：50~10化pm/min。
[0039] 更优选地，所述揽拌周期为每隔比揽拌lOmin。
[0040] 优选地，所述收集酶解液采用离屯、收集上清液或压滤收集滤液的方式收集。
[0041] 更优选地，所述离屯、收集上清液的条件：离屯、力：5000-10000g;离屯、时间： lO-eOmin;离屯、溫度：2-8°C。
[0042] 更优选地，所述压滤收集滤液的条件：压力：0. 1-0. 5MPa;滤网目数：40-200目。所 述压滤收集滤液采用压滤器进行。
[0043] 4)在步骤3)中获得的酶解液中加入硫酸钢水溶液，揽拌后静置，取沉淀产物离屯、 后收集沉淀物A;
[0044] 优选地，所述硫酸钢水溶液的浓度为15% -20% (m/V)。更优选地，所述硫酸钢水 溶液的浓度为20% (m/V)。
[0045] 优选地，所述硫酸钢水溶液与酶解液加入的体积之比为1 :1-4。
[0046] 优选地，所述揽拌条件为：揽拌时间为I-IOmin;揽拌器转速：1~10巧m/min。所 述揽拌为轻微揽拌。
[0047] 优选地，所述静置时间为12-2地。所述静置能够使反应液充分完成自组装。
[0048] 优选地，所述离屯、的条件为：离屯、力：1000-5000g;离屯、时间：5-30min;离屯、溫度： 2-8 °C。
[0049] 5)取步骤4)中获得的沉淀物A，加水重溶并调节抑，静置，将再