一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体的说，是关于一种副猪嗜血杆菌病四价 蜂胶灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌病又称革拉泽病是由副猪嗜血杆菌（HaemophilusParasuis，Hps) 引起的猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的传染病，主要感染断奶前后仔猪。近年来，由该 菌直接感染或混合感染给养猪业带来一定的经济损失已成为猪的主要病原之一。研究表 明，Hps血清型复杂，已确定的有15个血清型，还有15. 2~41 %的分离株不能确定血清型， 根据日本、德国、美国和西班牙等国的血清流行病学调查，以血清型4、5和13最为流行。Hps 在我国也普遍流行，以4、5、13和12型为主。针对该病在国内的流行现状，学者对流行菌 株和相应的防控措施作了很多研究。目前市场上Hps的二价、三价灭活疫苗起到了一定的 预防效果，而该病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效 果，一针能够防治Hps新病原引起的副猪嗜血杆菌病为养殖业迫切需要解决的问题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的提供一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法，该疫苗 抗体效价高，特别解决目前由于副猪嗜血杆菌新病原菌而导致的现有疫苗效果不佳的问 题，同时有效的简化免疫程序、节省劳动力，降低免疫成本。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0005] -种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原 为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03 株的抗原浓缩灭活，配苗时每毫升疫苗中各菌株的菌数多2. 0X109CFU，所述佐剂为蜂胶乙 醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8mg。
[0006] 进一步地，所述副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01 株和血清13型JX03株四种菌株抗原液灭活前活菌数彡5.OX109CFU/mL。
[0007] 进一步地，所述佐剂为优质蜂胶，经乙醇浸提获得。
[0008] -种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤：
[0009] (1)蜂胶乙醇浸出液制备：蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15°C冷冻 24-48h，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48-72h，冷却、 过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量多32g/mL;
[0010] (2)制备生产用菌种：将副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清 12型GZ01株和血清13型JX03株的菌种进行繁殖制备生产用菌种，并对该生产用菌种进行 纯粹检验；
[0011] (3)制备抗原液：将步骤（2)的生产用菌种分别接种到相应的制苗用培养基培养， 制备抗原液；并进行纯粹检验；
[0012] (4)活菌计数：分别从步骤⑶所获得的四种抗原液中取样，对副猪嗜血杆菌血清 4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌株进行活菌计 数，以确定培养的菌数；
[0013] (5)浓缩：将上述四种抗原液分别用中空纤维滤器浓缩，制得抗原浓缩液；
[0014] (6)灭活：两种抗原液经0. 3%加入甲醛溶液灭活制得灭活抗原液，并进行灭活检 验；
[0015] (7)疫苗成品完成：根据各菌株菌液活菌计数结果，每毫升疫苗中各菌株菌数含 量2.OX109CFU的配苗标准，量取所需量的副猪嗜血杆菌血清4型SD02株浓缩液、血清5 型HN02株浓缩液、血清12型GZ01株浓缩液、血清13型JX03株浓缩液置于配苗罐中，按照 每毫升疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须 彡32g/mL，用注射用水补充至10万毫升；2000rpm搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出 液，继续2000rpm搅拌15~20分钟，使其充分混合乳化，制得所述副猪嗜血杆菌病四价蜂 胶灭活疫苗。
[0016] 进一步地，所述步骤（5)中制得抗原浓缩液含菌数应彡1.OXK^CFU/mL。
[0017] 进一步地，所述步骤（5)中抗原浓缩液为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5 型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌种抗原液的2-4倍浓缩。
[0018] 进一步地，所述的步骤（7)的佐剂为蜂胶乙醇浸出液，所选蜂胶经乙醇浸提，制备 蜂胶乙醇浸出液干物质含量多50%。
[0019] 本发明的有益效果是：四价蜂胶灭活疫苗能更好的解决目前由于副猪嗜血杆菌新 病原菌而导致的现有疫苗效果不佳的问题，同时减少免疫注射产生的应激性，省时省力，且 能获得优良的免疫保护率，结合实际生产带来很大的便利。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例，对本发明的副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法作 进一步详细说明
[0021] 菌种：副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血 清13型JX03株菌种，由山东华宏生物工程有限公司实验室王晓丽、王永明分离提供。
[0022] 培养基：TSA培养基、TSB培养基，由实验室自制。
[0023] 试验动物：3~5周龄健康易感猪由实验动物房提供。
[0024] 主要试剂：氯化钠（分析纯）、甲醛溶液、蜂胶乙醇提取液由山东华宏生物工程有 限公司提供。
[0025] 一、蜂胶乙醇浸出液制备
[0026] 蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15°C冷冻24_48h，再用冷冻粉碎机磨碎 过筛，按1:4的比例加入95 %乙醇，在37°C浸提48-72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出 液（透明栗色溶液），浸出液的蜂胶干物质含量多32g/mL。
[0027] 二、制备生产用菌种
[0028] ①一级种子繁殖
[0029]取副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13 型JX03株冻干菌种分别用含NAD和新生牛血清的TSB培养基溶解后，划线接种于含NAD和 新生牛血清的TSA平皿上，置37°C培养24小时，然后按标准挑选5个以上的典型菌落，接种 含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37°C培养24小时，作为一级种子。在2~8°C保 存，应不超过5日。在培养基上继代不超过5代。
[0030] ②二级种子的繁殖
[0031] 用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含10%新生牛血清和 16yg/mLNAD的TSB培养基，置37°C振荡培养8~10小时，取样经纯检合格后作为二级种 子，在2~8°C保存，应不超过2日。
[0032] 三、制备抗原液
[0033] 米用发酵罐分别培养各菌株的菌液。按发酵罐容积总量的70%加入TSB培养基， 同时加入0. 01~0. 02%的消泡剂。蒸汽高压116°C灭菌20min，待其温度降至37~38°C 时，加入终浓度为10%的新生牛血清和16yg/mL的NAD，按培养基总量2%~4%加入二级 种子菌液，混勾，搅拌转速100~150rpm，37°C发酵培养8~10h。
[0034] 四、纯粹检查和活菌计数
[0035] 菌液培养完成后，取样用适宜培养基按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应 纯粹；同时取样用含NAD和新生牛血清的TSA平板，按现行《中国兽药典》附录进行活菌计 数。各菌株培养菌液活菌数应多5.OX109CFU/mL。
[0036] 五、浓缩
[0037] 采用0.22ym中空纤维滤器进行过滤浓缩至每种菌株菌液所含活菌数 彡1. 0X1010CFU/mL〇
[0038] 六、灭活