一种蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质生物技术领域，特别是涉及一种蛋白质药物制剂。
【背景技术】
[0002] 蚯蚓俗称地龙，作为一种中药材，具有很高的药用价值，在我国的应用已经有几千 年历史。据《本草纲目》记载：蚯蚓能治疗瘰疬溃烂、口舌糜疮，临床上常用来治疗骨折、 创伤、下肢溃烂等疾病。蚯蚓中含高度不饱和脂肪酸、核苷酸、酶类、蛋白质、蚯蚓解热碱等 多种物质，具有清热定惊、止咳平喘、活血通络、降压、抗溃疡、抗肝纤维化、利尿等功能。此 外，现代分离技术发现，蚯蚓中还含有纤溶酶、抗菌肽、多种抗氧化酶等活性成分，因此具有 止血镇痛、促进创伤愈合、抗氧化、抗血栓、调节免疫、抗心律失常、抗癌等作用。近几年蚯蚓 药用价值越来越受到重视，临床研究和应用也日益广泛。蚯蚓不仅在临床中用于药物治疗， 而且在动物营养饲料、土壤改良、环境治污、保护生态环境、物质循环以及维持自然界生态 平衡等方面发挥着特殊作用。
[0003]目前，治疗创伤的药物主要以化学合成药和中药内服和中药外敷为主。化学合成 药对用药者易产生药物的依赖性和耐药性，存在长期残留在动物和人体内的弊端，人们经 常食用药物残留的动物肉质，都会带来对身体潜在的伤害，从而引发不可逆转的后果。中药 一般由多种药物组成，成分复杂，内服或外敷使用均存在药理作用不明、药效欠佳、药效存 在不可控性、煎煮麻烦以及携带不便等问题。
【发明内容】
[0004] 为解决上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种药效明显、使用方便、安全可 靠、无毒副作用的蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供一种蚯蚓抗损伤制剂，该制剂的配方按体积比 为：蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-80 3~4%，0. 3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl 1 ~2%〇
[0006] 优选地，所述蚯蚓有效成分按照以下步骤制备：（1)取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净 泥沙，次日清水反复清洗干净；（2)取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作 处于4°C环境；（3)研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎；（4)冷冻离心三次，弃沉淀 得到蚯蚓粗提物；（5)使用30 kD和100 kD的超滤管进行超滤处理。
[0007] 优选地，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。
[0008] 优选地，该制剂按配方混合后进行过滤除菌再投入使用。
[0009] 优选地，所述4丘蝴有效成分的分子量为30-100 kD。
[0010] 优选地，该制剂为液状，给药方式为喷涂。
[0011] 优选地，所述组织研磨在冰水环境下进行，蚯蚓有效成分的整个制备过程在4°C环 境下进行，从而防止酶变性。
[0012] 优选地，所述组织研磨的具体操作为：将4°C、0. 2mol/L、pH=7.2的现配PBS缓冲 液与蚯蚓等体积混合置于组织研磨器中研磨。
[0013] 优选地，所述离心条件为4°C、12000r/min离心lOmin，且重复离心三次。
[0014] 优选地，该制剂具有创伤愈合作用，用于制备抗损伤药物。
[0015] 优选地，该制剂具有抑菌作用。
[0016] 本发明还提供一种蚯蚓抗损伤制剂的制备方法，包括以下步骤： 取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净； 取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作处于4°C环境； 研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎； 冷冻离心三次，弃沉淀得到蚯蚓粗提物； 使用30 kD和100 kD的超滤管进行超滤处理得到蚯蚓有效成分； 按配方蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-80 3~4%，0. 3mol/L蔗糖和甘油以及 NaCl 1~2%混合。
[0017] 优选地，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。
[0018] 本发明提供的一种蚯蚓抗损伤制剂所产生的有益效果如下：（1)该制剂经科学 方法制取，保证了动物和人体复杂生命系统以及复杂疾病防治的客观要求，具有多肽类药 物的优点，如具有明显的创伤愈合作用，是一种疗效可靠、毒副作用小、无环境污染的制剂； (2)该制剂属于蛋白类药物制剂，药效高，副作用低，不蓄积中毒，因为蛋白质类药物本身 是人体内源性物质或针对生物体内调控因子研发而得，通过参与、介入、促进或抑制人体内 或细菌病毒中生理生化过程而发挥作用，副作用低，药效高，针对性强，不会蓄积于体内而 引起中毒；（3)本发明可以带动蚯蚓养殖业及其附属产业的发展，改善日益恶化的环境，为 社会提供大量的就业岗位，缓解当下的就业压力，增加当地政府的税收收入。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0020] 首先，通过查阅大量文献可知，目前被学者探明的蚯蚓蛋白有多种，包括：抗菌肽、 蚓激酶、纤溶酶、过氧化物酶系、镇痛成分、促进创伤愈合成分等，对于提取蚯蚓蛋白方法 很多，检测到的目的蛋白分子量也较为明确，范围存在于1KD-600KD之间。因此选择合适 的蚯蚓蛋白进行提纯显得尤为重要。蚯蚓纤溶酶的分子量范围大致为16KD-50KD之间， 但分子量在29KD-34KD之间的体内纤溶、体外止血的溶栓凝血效果较强；蚯蚓抗菌肽分子 量主要范围为1KD-1.6 KD、5. 5KD-45 KD、510KD-536KD之间；蚯蚓过氧化物酶系分子量在 30KD-98KD以及230KD-340KD之间；镇痛、促进创伤愈合作用的蛋白分子量在90KD以下。
[0021] 因此，结合以上蛋白范围，根据实际可行性分析，筛除一部分较小的和分子量较大 的蛋白，实验最终确定提取蚯蚓抗损伤蛋白有效成分分子量范围为：3KD-100KD之间，本范 围内的蚯蚓蛋白既保证了纯度、疗效，同时兼顾了提取工艺的方便、快捷、可控性。
[0022] 其次，制备蚯蚓抗损伤制剂。
[0023] 具体步骤如下： (1)取太平二号蚯蚓，清水洗净，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净，将太平二号蚯 蚓至于滤纸上吸除残余水分。
[0024] (2)将4°C、0. 2mol/L、pH=7. 2的现配PBS缓冲液与蚯蚓等体积混合置于组织研磨 器中研磨，组织研磨器中应加入冰水混合物，保证在4°C环境下进行，以防止酶变性。充分研 磨好的蚯蚓研磨液及皮渣液利用超声波破碎仪充分破碎细胞，所得液体倒入普通EP管置 于4°C超低温冷冻离心机12000r/min，离心10min，取上清液，重复离心三次，再取上清液， 4°C保存蚯蚓粗提物。
[0025] (3)取30kD和lOOkD超滤管，将蚯蚓粗提物分别放入超滤管超滤，截取蚯蚓有效成 分。
[0026] (4)将蚯蚓有效成分、1-2丙二醇、吐温-80、0. 3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl按比 例混合。
[0027] (5)混合液用0.22微米滤菌筛过滤保存即可。
[0028] 通过以上步骤得到抗损伤制剂。
[0029] 取第（3)步所得的蚯蚓有效成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)及蛋白质 双向电泳的图谱扫描、ImageMaster相关软件进行图谱差异分析，最终得出实验中蚯蚓提取 物的蛋白分子量主要集中在15-35KD之间、45-55KD之间以及60-70KD之间。15-35KD之间 的条带表现为不连续性，60-70KD之间的条带最为明亮、且具有连续性。由于提取过程始终 保持pH=7.2、4°C，确保了提取蛋白的活性，结果与之前确定的目的蛋白范围相一致。
[0030] 其次，通过实验观察蚯蚓蛋白复合物在治疗创伤愈合和抗菌方面的应用 实验例1 :创面愈合实验观察蚯蚓抗损伤药物的创伤愈合作用效果 具体操作如下： (1)实验动物准备和分组 60只雌雄各半、大小相似、健康的KM小鼠实验前一周放入饲养笼中给予充足的食 物和水进行饲养，使之适应环境，减少应激反应对实验的影响。其中饲养室内温度控制在 22±2°(：，湿度为65%-75%，1211明暗交替进行。
[0031] 实验小鼠被随机分成三组，每组20只，A代表空白对照组，不用任何药物进行治 疗；B代表蚯蚓抗损伤组，给予蚯蚓提取物进行治疗；C组代表京万红组，给予京万红烫伤膏 (主要中药成分：地黄、当归、乳香、黄连、木鳖子、血竭等）进行治疗。
[0032] (2)对小鼠进行机械组织损伤 用8%硫化钠脱去小鼠背部区域的毛发，温水清洗擦干，小鼠用1%戊巴比妥钠（lg/ l〇〇ml)按公斤体重35mg/kg腹腔内注射麻醉，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒术区，于小 鼠后背距脊柱两侧lcm处用自制打孔器切割直径为lcm的圆形创伤口各1个，深度从皮肤 到肌层，肌层伤口的厚度约为0. 3cm，用生理盐水冲洗伤口、消毒。开放创面，充分止血，待清 醒后单笼饲养，分别做好组间标记。
[0033] (3)对创伤后小鼠进行给药处理 空白对照组小鼠创面直接暴露空气中，不做任何处理；京万红组创面外涂0. lg京万 红；蚯蚓抗损伤组创面喷涂0. lml蚯蚓提取物；三组早晚八点各换一次药物。垫料及鼠笼前 期进行杀菌消毒。
[0034] (4)对实验中小鼠进行临床观察和创面愈合计算 每次观察记录小鼠毛色，进食，活动、精神状态，创面色泽、质地、有无渗液、是否感染， 创周红肿变化，肉芽组织的生长情况、有无分泌物、周围组织水肿等情况。
[0035] 创面愈合率：采用透明纸片描记加称重法计算。小鼠于伤后3、7、ll、15d记录创面 愈合率。首先将创面面积描绘在透明薄膜上，再以此为模板，将质地均匀的硬纸片剪成同样 大小，然后用分析天平称质量。以硬纸片质量间接地表示创面面积大小。按下列公式计算 创面愈合率：创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积xl〇〇%。
[0036] 愈后瘢痕面积：造模后第30d，用薄膜覆盖于创面，记录创面大小，并在计算纸上 计算出创面面积，作为愈后瘢痕面积。
[0037] 创面愈合时间：以肉芽完全覆盖创面为治愈标准，达到创面愈合标准的时间为创 面愈合时间。
[0038] (5)临床观察的实验结果表明蚯蚓蛋白复合物具有治疗创伤，增强创伤愈合的效 果，具体表现如下： 造模和临床试验期间，无麻醉过量、创伤感染等原因造成小鼠死亡情况的发生。所有小 鼠无休克、腹泻、拒食、绝饮等病理性应激反应的发生。造模后第Id :所有小鼠创面均有出 血、周围组织水肿、