一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液及冻 存方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞（stemcell)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细胞。 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells， MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有自我复制、 自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下， 能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术 的最有希望的来源细胞之一。除此以外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内 皮生长因子（vEGF)、胎盘生长因子（PGF)、成纤维细胞生长因子（FGFs)、血小板源生长因子 (TOGF)、转化生长因子（TGF-P)、肝细胞生长因子（HGF)等在内的各种生长因子，这些生长 因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效 方法。
[0003] 人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，羊膜属于孕妇生产后的废弃物， 一个胎盘的羊膜面积大约有600cm2,而且羊膜易于从胎盘剥离，所以因羊膜具有取材方便， 原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源，是未来干细胞在医疗应用上具 有巨大潜力的理想种子细胞。
[0004] 间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作 为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的胎盘 羊膜间充质干细胞的冻存方法，使具有临床应用价值的胎盘羊膜间充质干细胞能在体外长 期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。
[0005] 胎盘羊膜间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有 特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低温冰箱或者液氮中 进行长期冻存。
[0006] 目前现有技术中，胎盘羊膜间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以DMS0 和血清为主要成分，另一种是以培养基、DMS0和血清为主要成分。此外还有一些配方是在 上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存胎盘羊膜间充质干细胞 均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种胎盘羊膜间充质 干细胞的冻存保护液及冻存方法。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液，包括
[0010] DMSO 10v/v% -20v/v%
[0011] 胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基 30v/v%-80v/v%
[0012] 胎牛血清 10v/v% _50v/v%。
[0013] 其中，所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液中所述胎盘羊膜间充质干细胞条 件培养基的制备方法为：取P1-P5代的胎盘羊膜间充质干细胞酶解消化后传代，连续培养 24_72h后，收集培养上清，离心后取上清。
[0014] 在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述 P1-P5代的胎盘羊膜间充质干细胞优选为汇合度80-90%胎盘羊膜间充质干细胞。
[0015] 在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所 述酶解消化具体为向细胞中加入〇. 〇 15mL/cm2-0. 04mL/cm2的0. 05 % -0. 3 %的胰酶和 0. 01 % -0. 04%EDTA消化lmin-3min，完全培养基终止酶解。
[0016] 在一些优选实施方案中，所述终止酶解的完全培养基的加入量为消化液体积的5 倍~10倍。
[0017] 在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述传 代为酶解消化后的细胞离心，完全培养基重选后，按80000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2 的传代密度传代，细胞连续生长24h-72h。
[0018] 其中，所述酶解消化后的离心优选为200g-400g离心5min。
[0019] 本领域技术人员可以理解，本发明所述完全培养基的组成为DMEM-F12 80v/ v%_95v/v%，FBS5v/v%_20v/v%。
[0020] 本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法在胎盘羊膜间充质干 细胞传代后收集培养上清，离心后取上清获得胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基。其中，所 述离心优选为200g_400g离心5min。
[0021] 本发明还提供了所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，按比例将 胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMS0,冰水浴中降温至0°C。
[0022] 本发明还提供了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存方法，将胎盘羊膜间充质干 细胞消化离心，加入胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度至〇. 1X106个/ mL-10X106个/mL，加入等体积的所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装 至冻存管中，-80°C中冻存1天-5天，转移至液氮中长久保存。
[0023] 其中，所述的冻存方法中，所述消化为向细胞中加入0. 015mL/cm2-0. 04mL/cm2的 0. 05% -0. 3%的胰酶和0. 01 % -0. 04%EDTA消化lmin-3min，用5倍-10倍于消化液的完 全培养基终止酶解。
[0024] 在一个具体实施例中，本发明分别采用不同的冻存保护液冻存胎盘羊膜间充质干 细胞，比较不同的冻存保护液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率以及细胞增殖情况，对比本 发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液与常规冻存液的冻存效果，结果显示虽然细 胞活率没有明显差异，但经本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏的 细胞回收率明显高于其他常规冻存液。而增殖情况结果显示本发明所述胎盘羊膜间充质干 细胞的冻存保护液冻存的细胞相对常规冻存液冻存的细胞，扩增的倍数更多。
[0025]由此可见，采用本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液，结合本发明所 述的冻存方法进行胎盘羊膜间充质干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果。复苏后的细胞 不仅在回收率上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规冻存液。
[0026] 本发明还提供了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述胎盘 羊膜间充质干细胞的冻存保护液。
[0027] 本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液包括10v/v% -20v/v%DMS0、 30v/v% -80v/v%胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基、10v/v% -50v/v%胎牛血清。与常规 细胞冻存液相比，采用本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，不仅 在细胞回收率上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液，可以用 于间充质干细胞的长期保存及应用。本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存方法将胎盘 羊膜间充质干细胞消化离心后，加入胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度，加 入等体积的本发明所述冻存保护液后冻存细胞。与常规的冻存方法相比，本发明胎盘羊膜 间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在细胞回收率上明显高于其他常规方法， 细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029] 图1示实施例1复苏后各组细胞增殖情况图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0031] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
[0032] 对比例1、
[0033] 分别采用表1中不同的冻存保护液冻存胎盘羊膜间充质干细胞，比较不同的冻存 保护液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率以及细胞增殖情况。
[0034] 表1不同的冻存保护液
[0035]
[0036] 冻存方法如下：
[0037] 1、配制胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基：取汇合度80%的P2代的胎盘羊膜间 充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0. 015mL/cm2的0. 25 %的胰酶+0. 04%EDTA消 化lmin，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离心5min，用完全培养基重选后， 接种于培养瓶中，传代密度为10000个细胞每cm2。细胞连续生长48h，收集培养上清，200g 离心5min，取上清，分装后置于-80°C保存备用。
[0038] 2、取汇合度80%的P3代的胎盘羊膜间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加 入0. 015mL/cm2的0. 25 %的胰酶+0. 04%EDTA消化lmin，用10倍于消化液的完全培养基 终止酶解，取样计数