法增加培养基表面放置叶片数量，提高诱导率，降低成本。连续光照增加愈伤组织的光合作用，促进组织增生。
[0018]D、愈伤组织继代增殖:
无菌条件下，从步骤C中选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取
2.0?5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度为22.0?28.0°C，每天连续光照12.0?24.0小时，光照强度1000?30001x。培养15?20天。
[0019]所述步骤A中外植体为健康无病害的黄芪叶片，外植体的清洗过程为无菌水清洗3遍，在体积浓度70%的乙醇溶液中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.10%?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5?12分钟，随后用无菌水清洗5遍。
[0020]实施例1:
A、外植体的选择与灭菌:以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗5遍，在体积浓度75%乙醇中浸泡30秒，随后放入质量浓度0.10%的HgCl2溶液中浸泡12.0分钟，随后用无菌水清洗3遍。
[0021]B、培养基灭菌:愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在10ml三角形培养瓶中，每瓶20.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.1OMPa下灭菌20.0分钟，冷却备用O
[0022]C、愈伤组织诱导:取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+ 6-BA 1.5mg/L+NAA 0.8 mg/L+ 鹿糖 20.0g/L+ 葡萄糖 10.0 g/L+ 琼脂 6g/L + 海藻酸钠 0.5g/L，pH 值为5.8。培养温度为28.0°C，每天连续光照24.0小时，光照强度30001x。培养20天后，愈伤组织诱导率为96.1%。
[0023]D、愈伤组织继代增殖:无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取2.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为:MS+ 6-BA 1.2mg/L+NAA 1.6 mg/L+鹿糖20.0g/L+葡萄糖5.0 g/L+麦芽糖8.0g/L +琼脂5.0g/L +海藻酸钠0.5g/L，pH值为5.8。培养温度为28.(TC，每天连续光照24.0小时，光照强度30001x。培养20天后，愈伤组织增殖4.3倍。
[0024]实施例2:
A、外植体的选择与灭菌:以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗3遍，在体积浓度72%乙醇中浸泡40秒，随后放入质量浓度0.12%的HgCl2溶液中浸泡8.0分钟，随后用无菌水清洗4遍。
[0025]B、培养基灭菌:愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在10ml三角形培养瓶中，每瓶22.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.1510^下灭菌20.0分钟，冷却备用。
[0026]C、愈伤组织诱导:取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度4.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+ 6-BA 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L+ 鹿糖 15.0g/L+ 葡萄糖 2.0 g/L+ 琼脂 3.5g/L + 海藻酸钠 0.2g/L，pH 值为5.6。培养温度为22.0°C，每天连续光照12.0小时，光照强度ΙΟΟΟΙχ。培养15天后，愈伤组织诱导率为86.4%。
[0027]D、愈伤组织继代增殖:无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取3.0_的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为:MS+ 6-BA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖2.0g/L+麦芽糖3.0g/L +琼脂3.2g/L +海藻酸钠0.3g/L，pH值为5.6。培养温度为22.0°C，每天连续光照12.0小时，光照强度1000 lx。培养15天后，愈伤组织增殖2.8倍。
[0028]实施例3:
A、外植体的选择与灭菌:以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗3遍，在体积浓度70%乙醇中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.15%的HgCl2S液中浸泡5.0分钟，随后用无菌水清洗5遍。
[0029]B、培养基灭菌:愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在10ml三角形培养瓶中，每瓶25.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.12MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用O
[0030]C、愈伤组织诱导:取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度5.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+ 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.6mg/L+ 鹿糖 18.0g/L+ 葡萄糖 8.0g/L+ 琼脂 4.0g/L + 海藻酸钠 0.3 g/L, pH 值为5.7。培养温度为25.0°C，每天连续光照20.0小时，光照强度2000 lx。培养18天后，愈伤组织诱导率为91.6%。
[0031]D、愈伤组织继代增殖:无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为:MS+ 6-BA 0.8mg/L+NAA 1.0mg/L+鹿糖18.0g/L+葡萄糖3.0g/L+麦芽糖5.0 g/L +琼脂4.0g/L +海藻酸钠0.4 g/L, pH值为5.6。培养温度为26.(TC，每天连续光照20.0小时，光照强度20001x。培养18天后，愈伤组织增殖倍3.2。
【主权项】
1.一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方，其特征在于包括如下组分:植物组织培养基MS、细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-BA、生长素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、琼脂、海藻酸钠，在植物组织培养基MS中添加6-BA 0.6?1.5mg/L、NAA 0.2?1.6mg/L、鹿糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?10.0g/L、麦芽糖3.0?8.(^凡、琼脂3.5?6.0g/L和海藻酸钠0.2?0.5g/L ;使用质量比0.5?4.0%Na0H溶液调整培养基溶液pH值为5.6?5.8。2.如权利要求1所述的一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方，其特征在于配方分为植物愈伤组织诱导培养基配方和继代增殖培养基配方； 植物愈伤组织诱导培养基配方为: 植物组织培养基MS中添加6-BA 0.8?1.5mg/L、NAA 0.2?0.8mg/L、蔗糖15.0?20.(^/1、葡萄糖2.0?10.(^/1、琼脂3.5?6.0g/L和海藻酸钠0.2?0.5g/L，用质量比0.5?4.0%Na0H调整培养基溶液pH值为5.6?5.8 ; 继代增殖培养基配方为: 植物组织培养基MS中添加6-BA 0.6?1.2mg/L、NAA 0.4?1.6mg/L、蔗糖15.0?20.0g/L、葡萄糖2.0?5.0g/L、麦芽糖3.0?8.0g/L、琼脂3.2?5.0g/L和海藻酸钠0.3?0.5g/L，用质量浓度0.5?4.0%Na0H调整培养基溶液pH值为5.6?5.8。3.如权利要求1或2所述一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法，其特征在于包括如下步骤: A、外植体的选择与灭菌: 以黄芪叶片为外植体，采集健康无病害的黄芪叶片，用无菌水清洗黄芪叶片3?5遍，在体积浓度70 %?75 %的乙醇溶液中浸泡30?50秒，随后放入质量浓度0.10 %?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5.0?12.0分钟，随后用无菌水清洗3?5遍； B、培养基灭菌: 愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在10ml三角形培养瓶中，每瓶20.0?25.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10?0.15MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用; C、愈伤组织诱导: 取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0?5.0mm的小段，接种到灭菌后的植物愈伤组织诱导培养基上，培养温度为22.0?28.0°C，每天连续光照12.0?24.0小时，光照强度1000?30001x，培养15?20天； D、愈伤组织继代增殖: 无菌条件下，从步骤C中选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取2.0?5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度为22.0?28.0°C，每天连续光照12.0?24.0小时，光照强度1000?30001x ;培养15?20天。4.如权利要求3所述的一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法，其特征在于步骤A中外植体为健康无病害的黄芪叶片，外植体的清洗过程为无菌水清洗3遍，在体积浓度70%的乙醇溶液中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.10%?0.15%的HgCl2溶液中浸泡5?12分钟，随后用无菌水清洗5遍。
【专利摘要】本发明涉及一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法。包括外植体选择与灭菌，培养基灭菌、愈伤组织诱导，愈伤组织继代增殖四个步骤。黄芪植物愈伤组织培养方法采用黄芪叶片为外植体，在MS基本培养基中加入麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、海藻酸钠、萘乙酸、6-苄基嘌呤等构成的培养基中进行组织培养，得到黄芪叶片愈伤组织。调培养基pH值，配制好的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代增殖培养基分别装在三角形培养瓶中，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10~0.15MPa下灭菌后进行愈伤组织培养。本发明可实现对黄芪叶片愈伤组织的有效诱导和快速增殖，在较短时间内获得大量黄芪叶片愈伤组织，具有生产周期短、增殖速度快的特点，适合工业化生产。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165626
【申请号】
【发明人】赵瑛, 罗俊杰, 王红梅, 张运晖, 崔明九, 叶春雷, 欧巧明, 薛莲
【申请人】甘肃省农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月22日