大。而随着光照强度的继续增加，对小白菜生长有明显的抑制作用。
[0025] 从图2可以看出，光照对小白菜氮素吸收的影响与对生物量的影响相似，光照强 度与氮吸收的拟合方程为：y= -2E- 05x2 + 0.0151x+ 0.5961 (R2 = 0.946广)，表明 小白菜吸收氮素的最适光照强度为360ymolm2s1。
[0026] 从图3光照强度对不同氮源的吸收来看，甘氨酸态氮与硝态氮的吸收随着光照强 度的增加而增加，直至414ymolmS1，而铵态氮在光照强度为414ymoln^s1的吸收 量却显著低于288和540ymolmb1。在相对较低的36ymolmb1光照强度下，硝态 氮的吸收量高于铵态氮的吸收量，而在相对较高的540ymolm2s1光照强度下，铵态氮的 吸收量要高于硝态氮。表明光照强度改变了小白菜对不同氮源的选择性吸收。
[0027] 从图4可以看出，在414ixmolmS1光强下，甘氨酸、硝态氮、铵态氮的营养贡献 率分别为29. 8%、38. 9%、和31. 2%。在无菌环境下，甘氨酸的营养贡献率为18-30%，表明 氨基酸可以作为植物生长的重要氮源。
[0028] 图5表明光照强度对小白菜吸收甘氨酸的方式具有显著的影响，高光照强度增加 了被动吸收的量，而在中等光照强度下主动吸收的量最大，低光照强度限制了主动和被动 吸收。
[0029] 从图6可以看出，光照强度对小白菜地上部甘氨酸态氮量具有较大的影响，高光 照强度增加了被动吸收的量，而在中等光照强度下主动吸收的量最大，低光照强度限制了 主动和被动吸收。
[0030] 从图7可以看出，光照强度对小白菜根系被动吸收甘氨酸态氮量具有较大的影 响，而对主动吸收无明显影响。
[0031] 图8表明，光照强度对被动吸收的甘氨酸向地上部的转移具有显著的影响，而对 根系被动吸收甘氨酸无显著的影响，表明光照强度主要影响了被动吸收的甘氨酸向地上部 的转移。
[0032] 综上所述，光照强度对植物生长及对不同氮源的吸收均具有显著的影响，低光照 下被动吸收显著降低，过高光照强度下被动吸收增加。该发明公布的一种测定光照影响植 物选择性吸收氮源的方法，结合了无菌培养与同位素标记的优势，为研究环境因素对植物 吸收氮源的影响提供了方法基础。
【主权项】
1. 一种测定光照影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 无菌苗的培育：选取饱满的植物种子，在常温下浸泡12h，之后采用70%酒精浸泡 1分钟-无菌水冲洗3次-10%过氧化氢浸泡5分钟-无菌水冲洗3次-0.1mol L 1氯化萊 浸泡5分钟-无菌水冲洗5次的灭菌方法，之后将灭菌后的种子放置于已高压灭菌的培养 皿中发芽3-5天，待植物根系生长至约lcm，将一粒种子放置于已灭菌的装满0. 5%琼脂的 50ml离心管中，置于无菌培养台上培养1-3天，植物通过离心管盖子中心的直径为0. 3cm的 小孔长出，采用南大704硅橡胶密封小孔，待硅胶定型后添加营养液； (2) 长期光照强度对植物选择性吸收氮源的影响：供试氮源为NO3、NH/、甘氨酸三 种，等氮量混合，总浓度为3mM，且每次只标记其中一种氮源，标记物丰度值为50. 22 at. % 15Ν03、50·17 at·% 15ΝΗ4+、50·16 at·% 15N-甘氨酸，光照强度为 36、162、288、414、540 ymol m 2 s 1五个梯度，共15个处理，采用离光源距离的远近来控制光照强度，每种光照强度处理 设置一空白，以检测自然丰度，每三天更换一次营养液，培养25天后，测定植物地上部及根 系的生物量及 15N丰度； (3) 短期特定光照强度对植物吸收氮源的影响：以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘 氨酸为氮源，采用步骤（1)方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗，采用无菌 水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中培养一整夜，将植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，以90、360、540 μ mol m2 S1三个光照强度处理，吸收4h后破坏 性采样； (4) 短期特定光照强度对植物吸收氮源方式的影响：以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵 +0. 5mM甘氨酸为氮源，采用步骤（1)方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗， 用无菌水将离心管及植物根系冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一整夜，选取6株长势一 致的植物幼苗，将其根系预先放置于50 μ mol L 1 CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后 以不用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，以 90、360、540 μπι〇1 m2 S1三个光照强度处理，进行标记氮源的短期吸收方式试验，吸收4h 后破坏性采样； (5) 样品处理：经过步骤（2)长期吸收和步骤（3)、（4)短期吸收的植物样品采收后，将 地上部和地下部分开，植物根系先用超声波清洗，然后用0.5 mol L1 CaCl2清除吸附在根 系表面的氮素，最后用无菌水冲洗干净，并用吸水纸吸干，植物根系和地上部样品用冻干机 冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏， 最后用0.01 mol L1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值； (6) 测定氮源： 植物对某一氮源的吸收是根据植物体内的15N含量来确定，采用以下公式计算：指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量；4是植物根系或者地上部的 15N丰度值；4指的是未添加标记氮源的15N空白丰度值；為是混合氮源中某一标记氮源 的丰度值，在长期光照对植物吸收氮源的影响中，为50. 16%甘氨酸、50. 22% NO3、50. 17% NH4+，在短期吸收中，为98. 10%甘氨酸：指的是植物地上部或根系的总 氮量。2. 根据权利要求1所述的一种测定光照影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征 在于，步骤（1)所述的无氮营养液的组成为：4 mmol L1CaCl2^ mmol L 1K2SO4,、2 mmol L 1KH2PO4' I. 4 mmol L 1MgSO4 · 7Η20、0· 1 μ mol L 1NaMoO4 · 2Η20、0· 4 Mmol L 1CuSO4 · 5Η20、 I Mmol L 1ZnSO4 ·7Η20、8 μ mol L1H3BO3UO Mmol L1MnCl2J Mmol L 1Na2EDTA和 18. 3 Mmol L 1FeSO4 · 7Η20。3. 根据权利要求1所述的一种测定光照影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在 于，步骤（4)中放置在无菌水中培养一整夜的时间为10小时。4. 根据权利要求1所述的一种测定光照影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在 于，步骤（1)试验中所用器具及营养液均采用高温高压灭菌，各氮源采用过0. 22 μ m滤膜灭 菌。
【专利摘要】本发明公布了一种测定光照影响植物选择性吸收氮源的方法。本发明通过培育无菌苗、测定长期光照强度对植物选择性吸收氮源的影响、短期特定光照强度对植物吸收氮源的影响、短期特定光照强度对植物吸收氮源方式的影响、样品处理、结果计算等过程，深入分析光照强度对植物吸收铵态氮、硝态氮、氨基酸的影响，为研究未来环境变化对植物生长尤其是氮素吸收的影响提供了方法基础。采用完全无菌的培养环境，可以深入分析氨基酸对植物的营养贡献，采用同位素标记技术，可以有效准确的区分光照强度对植物吸收不同氮源的影响。
【IPC分类】A01G7/04, A01G7/00, A01H4/00
【公开号】CN105165624
【申请号】
【发明人】马庆旭, 吴良欢
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月15日