)增殖培养:将原球茎转接到增殖培养基，光照培养55?60d得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为:l/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.8mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培养:将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，光照培养45?55d得到具有2?3片叶的小苗，分化率为80%，所述的分化培养基为:l/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.9mg/L+KT0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培养:将小苗转入生根培养基，光照培养55?60d得到高4?5cm的试管苗，生根率为 90%所述的生根培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L+NAAl.0mg/L+蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(6)炼苗移栽:挑选生长健壮、根系长至2?3cm的试管苗带瓶移至常温、无直射光条件下，炼苗10?15d，取出试管苗，用清水洗净培养基，移栽至苗床的腐叶土中，所用苗床下层铺5?7cm厚的粗砂，上层铺8?1cm厚的腐叶土，栽培环境要求通风良好，遮光70%?75%，空气相对湿度75%?80%，温度15?28°C，15?20d试管苗即可成活，移栽成活率达95% ；
(7)培养室光照培养条件为:温度25±2°C，光照10?12h/d，光照强度1100?1400LX。
[0008] 实施例3
一种卷萼兜兰组培快繁方法，包括以下步骤:
(1)外植体灭菌:人工授粉130d后，采集未开裂、饱满的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌20s，0.1%升萊灭菌lOmin，无菌水冲洗6次，再用0.1%升萊第二次灭菌3min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干表面水分；
(2)种子萌发培养:将灭菌后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，光照培养40?45d，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为VW+6-BA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培养:将原球茎转接到增殖培养基，光照培养55?60d得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为:l/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.7mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培养:将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，光照培养45?55d得到具有2?3片叶的小苗，分化率为82%，所述的分化培养基为:l/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.7mg/L+KT0.5mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培养:将小苗转入生根培养基，光照培养55?60d得到高4?5cm的试管苗，生根率为88%，所述的生根培养基为:1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.9mg/L+蛋白胨2.0g/L+AC1.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ;
(6)炼苗移栽:挑选生长健壮、根系长至2?3cm的试管苗带瓶移至常温、无直射光条件下炼苗10?15d，取出试管苗，用清水洗净培养基，移栽至苗床的腐叶土中，所用苗床下层铺5?7cm厚的粗砂，上层铺8?1cm厚的腐叶土，栽培环境要求通风良好，遮光70%?75%，空气相对湿度75%?80%，温度15?28°C，15?20d试管苗即可成活，移栽成活率达97% ；
(7)培养室光照培养条件为:温度25±2°C，光照10?12 h/d，光照强度1100?1400LX。
[0009]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种卷萼兜兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体灭菌:人工授粉130d后，采集未开裂、饱满的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌20s，0.1%升萊灭菌lOmin，无菌水冲洗6次，再用0.1%升萊第二次灭菌3min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干表面水分； (2)种子萌发培养:将灭菌后的蒴果在无菌条件下切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，光照培养40?45d，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为VW+6-BA0.1?0.3mg/L+NAA0.1 ?0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ; (3)增殖培养:将原球茎转接到增殖培养基，光照培养55?60d得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为:l/2MS+6-BAl.0 ?2.5mg/L+NAA0.5 ?0.8mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ; (4)分化培养:将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，光照培养45?55d得到具有2?3片叶的小苗，所述的分化培养基为:l/2MS+6-BA0.2?0.5mg/L+NAA0.6?0.9mg/L+KT0.4 ?0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ; (5)生根培养:将小苗转入生根培养基，光照培养55?60d得到高4?5cm的试管苗，所述的生根培养基为:1/2MS+IBA0.2 ?0.5mg/L+NAA0.8 ?1.0mg/L+ 蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，PH 为 6.5 ?7.2 ; (6)炼苗移栽:挑选生长健壮、根系长至2?3cm的试管苗，带瓶移至常温、无直射光环境下，炼苗10?15d，取出试管苗，用清水洗净培养基，移栽到苗床基质中，环境要求通风良好，遮光70%?75%，空气相对湿度75%?80%，温度15?28°C，15?20d试管苗即可成活。2.根据权利要求1所述的一种卷叶兜兰组培快繁方法，其特征在于，步骤(6)所述的苗床基质铺设方法为:苗床下层铺5?7cm厚的粗砂，上层铺8?1cm厚的腐叶土。
【专利摘要】本发明公开了一种卷萼兜兰组培快繁方法，属于植物组织培养研究领域。包括如下步骤：（1）外植体灭菌，（2）种子萌发培养，（3）增殖培养，（4）分化培养，（5）生根培养，（6）炼苗移栽。本方法实现了卷萼兜兰的组织培养和快速稳定繁殖，得到的再生植株性状稳定、苗齐、苗壮，生根率达88%以上，移栽成活率达95%以上，能够进行大规模商品化育苗生产，对于这一珍贵野生种质资源的保护及其开发利用具有重要意义。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165622
【申请号】
【发明人】张桂玲, 温四民
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月12日