~4 ;黄化、白化等不良变异率低于1 %，直至繁殖 出所需的种苗数量，可转入壮苗生根培养。其中，所述的继代增殖培养基组成为：6_苄氨基 噪呤 1.Omg/L+ 萘乙酸 0? 5mg/L+ 土豆汁 60g/L+ 鹿糖 30g/L+ 琼脂 6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS 培养基+PH5.8 ;此配方种苗增殖率高，增殖速度快，且变异率较低，通常低于1%。
[0032] (4)将步骤（3)得到的三叶青小苗剪成带1个腋芽的小段并转移到壮苗生根培养 基中，在25~28°C、光照1500勒克斯左右、光照时间12h/d的条件下培养50~60d，当三 叶青小苗长成4~5cm高，有2~3条根时，即可进行驯化移栽，其中，所述的壮苗生根培养 基组成为：萘乙酸0. 2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉汁60g/L+琼脂6g/L+活性炭0. 5g/L+White 培养基+pH5.8。
[0033] (5)将步骤（4)得到的成苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后放入温室，移置 铺有营养土的苗床上，并遮阴保湿，待小苗长到15cm高时，即可进行大田移栽，移栽成活率 达90%以上；其中，温室内温度为28~33°C，光照强度为6000~8000勒克斯。
[0034] 实施例2:
[0035] 与实施例1基本相同，步骤（2)、步骤（3)、步骤（4)中腋芽萌发，继代增殖培养、壮 苗培养三个阶段分别以表1所列培养基组合进行筛选，以优选最适培养基组合配方。表1 说明如下：
[0036] ①培养基配方优化主要是设计不同的基础培养基、激素浓度等对培养基进行了优 化设计，本实例中均设计成固体培养基，每种配方中琼脂浓度均为6g/L，蔗糖为30g/L，培 养环境为温度25°C、光照度1000~2000勒克斯、光照时间12h/d培养室内。②针对生产， 不同的培养阶段设计了培养基配方，三叶青腋芽萌发阶段主要观察腋芽萌发的快慢、长势、 颜色（翠绿为佳）等指标判断配方是否合理；继代增殖阶段主要观察小苗分枝情况（越多 越好）、玻璃化程度（越低越好），发生黄化、白化等变异的程度（越低越好）等指标判断配 方是否合理；壮苗生根培养阶段，主要通关观察苗的生长势、生根情况、玻璃化程度（越低 越好）、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，并用"★"和"☆"的 多少代表配方的好坏，★越多表示越好，☆比★要低一个等次。
[0037] 表1培养基配方筛选
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] 试验表明，腋芽萌发阶段（步骤2) 18种配方组合中，基础培养基和激素组合范围 为6-节氨基噪呤0~1. 0mg/L+鹿糖25~30g/L+琼脂4. 5~6g/L+ 土豆汁60~80g/L+ 活性炭〇. 5g/L+MS培养基+pH5. 6~5. 8 ;在此培养基范围内，腋芽萌发速度快，生长旺盛， 是较适宜的组合配方组合，带腋芽的茎段接种培养基后40~50d，腋芽萌发，并长至1~ 2cm;继代增殖阶段（步骤3) 32种配方组合中，基础培养基、激素及天然添加物组合范围为 6-节氨基噪呤0~1. 〇mg/L+萘乙酸0~0? 5mg/L+ 土豆汁60~80g/L+鹿糖25~30g/L+ 琼脂4. 5~6g/L+活性炭0. 5g/L+MS培养基+pH5. 6~5. 8 ;在此培养基范围内，苗的生长 势良好、增殖速度快、玻璃化程度低，50~60d可继代转接一次，增殖系数可达3~4 ;壮苗 阶段（步骤4)，结果表明，萘乙酸0? 2~0? 5mg/L+蔗糖25~30g/L+香蕉汁60~80g/L+ 琼脂4. 5~6g/L+活性炭0. 5g/L+White培养基+pH5. 6~5. 8为优选培养基配方组合。在 试验中还发现土豆对三叶青腋芽萌芽及小苗的增殖发有较好的促进作用，香蕉汁有利于三 叶青小苗的壮苗生根。
【主权项】
1. 一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴选取三叶青的枝条，去除叶片后剪成5~IOcm的茎段，用去污剂清洗IOmin后，再 用流水冲洗IOmin;将剪切冲洗后的三叶青茎段于体积分数为75%体积分数的乙醇水溶液 中浸泡30~60s，再于氯化萊水溶液中浸泡5~8min;最后用无菌水冲洗3~5次后备用； (2) 将经步骤（1)处理后的三叶青茎段剪成带1~2个腋芽的小段，接种于固体培养基 中；培养40~50天后腋芽萌发，摘取芽长1~2cm的腋芽备用； (3) 将步骤（2)中所得的腋芽置于增殖继代培养基中培养50~60d;培养完成后，三叶 青腋芽生长成无根小苗且在茎节处产生侧芽； (4) 将步骤（3)中所得三叶青无根小苗剪成带1个腋芽的小段并移至壮苗生根培养基 中培养50~60天，得到三叶青成苗； (5) 选取步骤（4)中得到的4~5cm高，有2~3条根的三叶青成苗移到温室中，驯化 培养10~15天后，用水冲洗去除培养基后，将三叶青成苗移栽到铺有营养土的苗床上；待 三叶青成苗的苗高达到15cm后，即可进行大田移栽。2. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（1) 中，所述的三叶青枝条为当年生半木质化茎段。3. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（1) 中，所述的去污剂为家用洗衣粉。4. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（1) 中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的质量分数为〇. 1 %~〇. 15%。5. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（2) 中，培养条件为22~25°C，光照强度为300~1000勒克斯，光照时间为11~13h/d;其中， 所述的固体培养基的配方包括：6_苄氨基嘌呤0~I.Omg/L+蔗糖25~30g/L+琼脂4. 5~ 6g/L+ 土豆汁 60 ~80g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培养基+pH5. 6 ~5. 8。6. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（3) 中，培养条件为25~28°C，光照强度为1000~2000勒克斯，光照时间为11~13h/d;其中， 所述的增殖继代培养基的配方包括：6_节氨基噪呤0~I.Omg/L+萘乙酸0~0. 5mg/L+ 土 豆汁60~80g/L+蔗糖25~30g/L+琼脂4. 5~6g/L+活性炭0? 5g/L+MS培养基+pH5. 6~ 5. 8〇7. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（4) 中，培养条件为25~28°C，光照强度为1000~2000勒克斯，光照时间为11~13h/d;其 中，所述的壮苗生根培养基的配方包括：萘乙酸〇. 2~0. 5mg/L+蔗糖25~30g/L+香蕉汁 60 ~80g/L+ 琼脂 4. 5 ~6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+White培养基+pH5. 6 ~5. 8。8. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（5) 中，温室内温度为28~33°C，光照强度为6000~8000勒克斯。9. 根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤（5) 中，所述的营养土为由泥碳土和蛭石以3 :1的体积比混合而成。
【专利摘要】本发明公开了一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，它将三叶青当年生半木质化茎段经过消毒，漂洗后，剪成带1～2个腋芽的小段接种于固体培养基中培养；待腋芽萌发后将其接种到增殖培养基上进行培养，每过50～60天转接一次，直到达到需要的种苗量，再将其接种到生根培养基上进行生根培养，50～60天后，当三叶青小苗生长出2～3条根，即可进行驯化移栽。与现有技术相比，本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，运输方便，移栽成活率高等优势。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165616
【申请号】
【发明人】史俊, 贾君, 席刚俊, 汪善锋, 徐超, 杨鹤同
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月30日