用于大分子复合物的质谱分析的方法和设备的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及质谱分析法领域，尤其是大分子复合物例如天然蛋白质复合物的质谱分析法。本发明的多个方面涉及此类复合物的MS2和MS 3分析。
【背景技术】
[0002]质谱仪被广泛用于基于离子的质荷比(m/z)来分析离子。质谱分析法已经成为分析蛋白质的一种主要技术。最近，质谱分析法已经被应用到分析大蛋白质复合物。与质谱分析法联用的电喷射电离的发展已经使得能够分析大的完整蛋白质复合物，甚至当后者通过弱的非共价相互作用保持在一起时。鉴于蛋白质复合物在生物系统中作为多种功能模块的作用，对它们的研究是重要的。因此一个新的领域已经出现，被称为天然蛋白质质谱分析法，集中于在接近生理条件下(即，在大约中性pH下)分析这些种类。
[0003]典型地，在天然条件下产生的大的完整复合物离子具有相对高的质量和相对低的电荷状态以及因此高的m/z (典型地超过m/z 5，000，或超过m/z 10,000)。因此，对于这些大的完整复合物离子本身的质量分析，它已经变为飞行时间(TOF)质量分析器的典型应用，由于这些质量分析器用于评估非常高的m/z的能力，常常与专用的四极滤质器相结合(在非常低的频率下运行以扩展质量范围)。然而，最近，静电质量分析器例如轨道阱也已经用于天然蛋白质复合物(US-2014-0027629-A1)，具有质量分辨率上的优势。
[0004]然而，对于蛋白质复合物的单体结构的完全分析和识别，需要应用串联或MSn质谱法。在现有技术中已经描述了许多用于完整蛋白质复合物的解离的方法，包括碰撞诱导解离(CID)、电子俘获解离(ECD)和表面诱导解离(SID)。最近在Belov，M.E.;Damoc, E.；Denisov, E.； Compton, P, D, ；Makarov, A, A, ；Kelleher, N, L.分析化学(Anal.Chem.),2013, 85，11163 - 11173中已经总结和讨论了在此领域中的大部分现有技术。在该论文中，已经示出了一些相对小的蛋白质复合物可以成功地解离为组分单体子单元，然后在高能碰撞解离室(HCD室)中对这些组分单体子单元进而进行预选择和碎裂。该方法依赖于在轨道阱(Orbitrap?)质谱仪的包括具有注入扁平极杆(flatapole)的双离子漏斗接口的源、质量选择器和HCD室之间在“飞过(fly-through) ”模式下的天然蛋白质复合物的解离。然而，已经发现那种方法对于一些大的复合物例如GroEL天然复合物是不可靠的并且已经发现其不适用于大的异源复合物(例如，GroEL-GroES 14:7复合物)。
[0005]在另一种现有技术方法中，已经研究了这些天然蛋白质复合物在离子迀移/飞行时间质谱仪(IMS-T0FMS)的截取锥区域中的活化(Ruotolo, B.T.；Giles, K.；Campuzano, 1.；Sandercock, A.M.；Bateman, R.H.；Robinson, C.V.在不存在本体水情况下大分子蛋白质环的证据(Evidence of macromolecular protein rings in the absenceof bulk water).科学杂志(Science), 2005, 310, 1658-1661 ;以及Benesch, J.L.P.蛋白质复合物的碰撞活化:拾取片段(Collis1nal activat1n of protein complexes:pickingup the pieces).美国质谱学会志(J.Am.Soc.Mass Spectrom.)，2009，20，341-348)。如由IMS测量证实的，报告了感兴趣的蛋白质复合物的重构和去折叠。然而，未观察到天然蛋白质复合物的解离(即，单体子单元的喷射)，可能由于在截取锥接口中的升高的压力。
[0006]因此，所希望的是提供用于更宽范围的大蛋白质复合物的碎裂的更有效的方法和设备。
[0007]鉴于以上背景，做出了本发明。
【发明内容】
[0008]根据本发明的一个方面，提供了一种通过质谱法分析大分子复合物离子的方法，该方法包括:
[0009]将大分子复合物离子引入第一碎裂装置中并且将其中的复合物离子俘获持续俘获时间段；
[0010]在该第一碎裂装置中将这些俘获的复合物离子碎裂以产生单体子单元离子；
[0011]通过m/z任选地选择一种或多种子单元离子的种类；
[0012]将该一种或多种子单元离子的种类引入第二碎裂装置中，该第二碎裂装置在空间上与该第一碎裂装置分开；
[0013]在该第二碎裂装置中将这些子单元离子碎裂以产生这些子单元离子的第一碎片离子；并且
[0014]在质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，并且使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。
[0015]该俘获时间段优选至少2ms (毫秒)。在一个优选的实施例中，该方法可以包括将这些大分子复合物离子作为连续流引入该第一碎裂装置中，其中该俘获时间段是至少2ms ;该方法进一步包括:
[0016]将这些单体子单元离子作为包从该第一碎裂装置喷射到该第二碎裂装置；
[0017]重复在该第一碎裂装置中俘获这些复合物离子和将这些子单元离子包从该第一碎裂装置喷射的步骤以便在该第二碎裂装置中积累多个子单元离子包；
[0018]在该第二碎裂装置中将该积累的多个子单元离子包碎裂以产生这些子单元离子的第一碎片离子；并且
[0019]在该质量分析器中对这些第一碎片离子进行质量分析，并且使这些第一碎片离子经受一个或多个另外的碎裂步骤以形成另外的碎片离子并且对这些另外的碎片离子进行质量分析。
[0020]本发明总体上在两个空间上分开的碎裂步骤中实施，使得能够分别进行MS2和MS30该第一和第二碎裂装置总体上按与离子源的距离的顺序安排，即，该第一碎裂装置(用于MS2)定位为最靠近该离子源而该第二碎裂装置(用于MS3)定位为距该离子源最远。优选地，在如以下更详细描述的条件下在该第一碎裂装置中将这些复合物离子俘获或积累进行碎裂持续第一俘获时间段。另外地，在如以下更详细描述的条件下，在该第二碎裂装置中将这些产生的子单元离子总体上俘获或积累进行碎裂，例如持续第二俘获时间段。
[0021]这些复合物离子和这些子单元离子总体上通过碰撞诱导解离(CID)机理进行碎裂。这些单体子单元离子的种类可以是具有不同质荷比(m/z)的种类，这些单体子单元是这些复合物离子的单体。典型地，这些单体子单元是在该复合物中非共价地结合的复合物离子的单体，例如这些单体子单元可以是蛋白质复合物的蛋白质单体(蛋白质)。优选地，该方法包括在该第一碎裂装置的下游和该第二碎裂装置的上游通过m/z选择一种或多种子单元离子的种类，由此以此方式通过m/z选择的一种或多种子单元离子的种类被该第二碎裂装置接收。
[0022]除了分析这些碎片离子的步骤之外，本发明还包括对这些子单元离子和/或这些复合物离子进行质量分析，在这种情况下这些子单元离子可以被传递到质量分析器进行分析而无需这些子单元离子进入该第二碎裂装置和/或这些复合物离子可以被传递到质量分析器进行分析而无需在该第一碎裂装置中被俘获或碎裂。
[0023]该一个或多个另外的碎裂步骤可以在该第一和/或第二碎裂装置中进行，如将从以下说明中清楚的。
[0024]本发明还提供进行该方法的设备。
[0025]在又另一个方面中，本发明提供一种包括堆叠环组件的碎裂装置以接收从离子源产生的复合物离子。包括堆叠环组件以接收从离子源产生的离子的该碎裂装置可以用作本发明的多个方面的第一碎裂装置。
[0026]在又还另一个方面中，本发明提供一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括:
[0027]离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；
[0028]第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括堆叠环组件离子阱并且用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子，该离子阱用于接收从该离子源产生的复合物离子并且将这些离子俘获持续俘获时间段；
[0029]任选地在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的子单元离子；
[0030]在空间上与该第一碎裂装置分开的第二碎裂装置，该第二碎裂装置用于接收来自该第一碎裂装置的子单元离子并且被配置成将这些子单元离子碎裂；以及
[0031]质量分析器，该质量分析器用于接收来自该第一和/或第二碎裂装置的离子并且对这些离子进行质量分析。
[0032]在一个另外的方面中，本发明提供一种用于对大分子复合物离子进行质量分析的质谱仪，该质谱仪包括:
[0033]离子源，该离子源用于产生大分子复合物离子；
[0034]第一碎裂装置，该第一碎裂装置包括用于接收从该离子源产生的复合物离子的离子阱，其中该离子阱被配置成栗抽到高于约12Hibar的压力(优选从约10 2Hibar至约10 1Hibar)，以将这些复合物离子俘获持续至少2ms的时间段并且以提供这些复合物离子的每个元电荷从约100至300V的碰撞能量用于将这些复合物离子至少碎裂为单体子单元离子;
[0035]任选地在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的子单元离子；
[0036]在空间上与该第一碎裂装置分开的第二碎裂装置，该第二碎裂装置用于接收来自该第一碎裂装置的子单元离子并且被配置成将这些子单元离子碎裂；以及
[0037]质量分析器，该质量分析器用于接收来自该第一和/或第二碎裂装置的离子并且对这些离子进行质量分析。
[0038]该设备优选包括在该第一碎裂装置下游的滤质器，该滤质器用于通过m/z选择来自该第一碎裂装置的离子。然后该第二碎裂装置优选在该滤质器的下游。
[0039]在再另外一个方面中，本发明提供一种用于质谱仪的离子阱碎裂装置，该离子阱包括两个不同地栗抽的区段，其中较高压力区段定位为比较低压力区段距质量分析器更远，该离子阱可以用作该第二碎裂装置。
[0040]在一个另外的方面中，本发明提供一种质谱仪，该质谱仪包括:
[0041]离子源；
[0042]碎裂装置；以及
[0043]质量分析器，该质量分析器用于接收来自该碎裂装置的离子并且对这些离子进行质量分析，
[0044]其中该碎裂装置是离子阱，该离子阱包括两个不同地栗抽的区段:较高压力区段和较低压力区段，并且该较高压力区段包括堆叠环组件。
[0045]任选地，该较高压力区段定位为比该较低压力区段距该质量分析器更远。
[0046]优选地，在本发明的其他方面中包括两个不同地栗抽的区段